周平秀 胡濟(jì)安 孟祥勇

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔病理科，杭州 310006；2.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院 口腔系，湖州 313000）

正畸牙移動(dòng)是在矯治力作用下發(fā)生的以牙槽骨吸收和增生為主的一系列復(fù)雜的生物過程，其中破骨細(xì)胞的分化成熟是正畸牙移動(dòng)過程中牙槽骨吸收的必要條件。破骨細(xì)胞分化成熟過程中的分子機(jī)制已成為正畸牙移動(dòng)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)問題[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)：核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）聯(lián)合巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）能夠誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞。另有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)：在這一過程中RANKL和MCSF誘導(dǎo)了核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、髓細(xì)胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）等多個(gè)生物信號分子，激活了腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Wnt等多條信號通路。本研究嘗試?yán)没蛐酒瑪?shù)據(jù)構(gòu)建RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟過程中的蛋白—蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析找出在誘導(dǎo)過程中可能發(fā)揮重要作用的基因和基因間關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)分析

RANKL聯(lián)合M-CSF共同誘導(dǎo)小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7（誘導(dǎo)72 h）的原始的公共基因芯片數(shù)據(jù)GES16749由NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫提供，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由Mann等[5]于2010年發(fā)表。利用dCHIP軟件對原始基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，隨后比較聯(lián)合刺激和對照組間的基因表達(dá)值，得到表達(dá)顯著變化的基因，即和對照組相比差異大于等于10倍的基因。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從小鼠PPI數(shù)據(jù)庫NIA中下載小鼠物種中所有可能的PPI關(guān)系[6]。利用小鼠的PPI關(guān)系分析表達(dá)顯著變化基因的鄰接基因。利用顯著變化基因的鄰接基因間的相互作用關(guān)系構(gòu)建RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)下的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件R中的圖像分析軟件包iGRAPH得到PPI網(wǎng)絡(luò)的基本參數(shù)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的度分布

網(wǎng)絡(luò)研究中度的定義為網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)節(jié)點(diǎn)的臨邊數(shù)（等價(jià)于這個(gè)節(jié)點(diǎn)的直接鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目）。據(jù)此筆者利用統(tǒng)計(jì)分析軟件R分析了RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)下PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的度。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的介數(shù)分析

網(wǎng)絡(luò)研究的介數(shù)的定義為：網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)節(jié)點(diǎn)的介數(shù)等于網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)對之間通過該節(jié)點(diǎn)的最短路徑條數(shù)。據(jù)此筆者用統(tǒng)計(jì)分析軟件R分析了RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)下PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的介數(shù)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的度數(shù)和介數(shù)作圖，利用函數(shù)（fx）=衡量基因在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。上式中d表示基因在PPI網(wǎng)絡(luò)的度數(shù)，b表示基因在PPI網(wǎng)絡(luò)的介數(shù)。

1.6 關(guān)鍵基因間的相互作用關(guān)系分析

利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析軟件CytoScape v2.8.1中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)件最短路徑分析插件，得到關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)下PPI網(wǎng)絡(luò)中的相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)育過程中的PPI網(wǎng)絡(luò)

對芯片數(shù)據(jù)GES16749分析后發(fā)現(xiàn)：以對照組為參照，在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)組中出現(xiàn)了97個(gè)10倍及以上差異表達(dá)的基因。利用小鼠PPI數(shù)據(jù)庫NIA，得到由這些顯著差異基因及其鄰接基因構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖 1 RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化發(fā)育過程中的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 1 PPI network of RANKL and M-CSF induced osteoclasts maturing

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件R中的iGRAPH分析可以得出，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有743個(gè)基因節(jié)點(diǎn)和821條邊（基因間相互作用關(guān)系），見表1。

表 1 RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)育過程中PPI網(wǎng)絡(luò)的基本參數(shù)Tab 1 Main parameters of PPI network in RANKL and M-CSF induced osteoclasts maturing

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的度分布

通過對PPI網(wǎng)絡(luò)中基因度分布的分析發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）、勞氏肉瘤原癌基因（Rous sarcoma oncogene，SRC）、MYC、整合素β3（integrin beta 3，ITGB3）、整合素α5（integrin alpha 5，ITGAⅤ）、鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase，GDA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、小鼠γ絲蛋白C（filamin C gamma，F(xiàn)LNC）、巨噬細(xì)胞刺激蛋白受體（macrophage stimulating 1 receptor，MST1R）和基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinases-14，MMP-14）具有較多的鄰接基因（圖2）。這提示在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)過程中，上述基因具有能夠和多種蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用的能力，它們可能是對分化過程具有重要影響的關(guān)鍵基因。

圖 2 PPI網(wǎng)絡(luò)中的度分布Fig 2 Node degree distribution of PPI network

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的介數(shù)

為進(jìn)一步分析PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，本研究分析了網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)基因節(jié)點(diǎn)的介數(shù)，介數(shù)表示了該基因節(jié)點(diǎn)能夠出現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)中每兩個(gè)基因節(jié)點(diǎn)最短路徑上的次數(shù)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，基因節(jié)點(diǎn)的介數(shù)很好地描述了每個(gè)基因節(jié)點(diǎn)可能需要承載的信號傳導(dǎo)流量。在分析結(jié)果時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)SRC、TGFBR1、MYC、ITGB3等是PPI網(wǎng)絡(luò)中重要的信號承載分子（圖3）。

圖 3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子Fig 3 Key molecular of PPI network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子

為找出誘導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子，本研究綜合分析了PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的度數(shù)和介數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3基因具有較高的度數(shù)和介數(shù)（圖3）。這提示在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)過程中，這4個(gè)分子能夠和多種蛋白質(zhì)分子相互作用，同時(shí)也承載著重要的信號傳導(dǎo)功能，它們很可能是RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵分子。

2.5 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子間的相互作用關(guān)系

為進(jìn)一步分析關(guān)鍵分子TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3間的相互作用關(guān)系，本研究在PPI網(wǎng)絡(luò)中尋找這4個(gè)關(guān)鍵分子間的最短相互作用路徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這4個(gè)關(guān)鍵分子能通過2個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)的分子腎上腺素受體β2（adrenergic receptor beta 2，ADRB2）與DAB2（disabled homolog 2 Drosophila），以及3個(gè)基因表達(dá)水平無明顯變化的分子BCR（breakpoint cluster region）、CSNK2A2（casein kinase 2 alpha prime polypeptide similar to casein kinaseⅡalpha prime subunit）和RAF1（Ⅴ-raf-leukemia viral oncogene 1）發(fā)生相互作用（圖4）。相關(guān)基因的差異表達(dá)值和網(wǎng)絡(luò)屬性見表2。

圖 4 關(guān)鍵分子在PPI網(wǎng)絡(luò)上的相互作用關(guān)系預(yù)測Fig 4 Prediction of interactions between key genes in PPI network

表 2 關(guān)鍵基因及其相互作用基因列表Tab 2 List of key genes and their neighbor genes

3 討論

隨著生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，不同類型的生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，例如基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在認(rèn)識(shí)特定生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用。而隨著口腔正畸學(xué)基礎(chǔ)研究的不斷深入，高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)日益豐富，特定生物學(xué)問題也不斷涌現(xiàn)，為系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)口腔正畸過程帶來了新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[5]。

本研究嘗試?yán)没蛐酒瑪?shù)據(jù)和蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)正畸牙移動(dòng)中的一個(gè)重要生物過程——RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟過程，并構(gòu)建了針對這一特定分化發(fā)育過程中可能存在的PPI網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，筆者推測RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程的關(guān)鍵分子可能是TGFBR1、SRC、MYC和ITGB3，其周邊基因可能是ADRB2、BCR、RAF1、CSNK2A2和DAB2。在這些分子中TGFBR1是轉(zhuǎn)化生長因子信號通路中上游的細(xì)胞膜受體，是細(xì)胞接收細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)化生長因子β的主要受體之一[7]。TGFBR1在RANKL聯(lián)合MCSF刺激后的基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果提示：細(xì)胞在接受早期外界信號刺激后，能夠在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生新的膜受體以接受外界不斷變化的信號分子，從而保障分化過程中細(xì)胞與外界信號的交流。這一結(jié)果提示轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)分化過程中發(fā)揮著重要作用。在對其他關(guān)鍵分子的研究[8]中發(fā)現(xiàn)：MYC是RANKL下游不可或缺的分子，在破骨細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮著調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵作用。BCR、RAF1參與激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，能夠促進(jìn)造血細(xì)胞早期發(fā)育過程[9]。根據(jù)圖4結(jié)果可以看出，在RANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)過程中，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的信號很可能從BCR的磷酸化開始（BCR在誘導(dǎo)過程中的基因表達(dá)水平無明顯變化），改變RAF1的磷酸化水平，并進(jìn)一步激活MYC發(fā)揮調(diào)控單核細(xì)胞增殖的作用。而在誘導(dǎo)過程中差異表達(dá)顯著的SRC也能激活MYC調(diào)控細(xì)胞的增殖[10]。同時(shí)SRC作為ErbB信號通路中的重要分子還能夠激活黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞黏附分子的作用[11]。這些結(jié)果說明：細(xì)胞黏附分子的改變作為破骨細(xì)胞分化的重要步驟，在伴隨著細(xì)胞增殖的過程中也逐步發(fā)生了。

生物信息學(xué)分析為認(rèn)識(shí)特定的生物學(xué)問題提供了新方法，然而對生物學(xué)問題的深入認(rèn)識(shí)仍然需要在分子生物學(xué)水平進(jìn)行研究。后續(xù)研究將結(jié)合本研究結(jié)果，展開分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討RANKL聯(lián)合MCSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中分子間的相互作用。

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