仇波，劉源，王勇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110001）

近年來，腦外傷發(fā)生率明顯增加。目前關(guān)于顱腦損傷的研究側(cè)重于如何防治繼發(fā)性腦損害，例如腦水腫、腦缺血缺氧、神經(jīng)元凋亡等。人類海馬區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)記憶緊密相關(guān)，且對(duì)腦外傷極為敏感，傷后神經(jīng)元大量變性壞死，導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙［1］。因此，研究腦損傷后海馬神經(jīng)元的凋亡與損傷機(jī)制具有重要意義。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，一般情況下適量TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等作用［2］；也可通過多種機(jī)制作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)—內(nèi)分泌功能、介質(zhì)釋放、抗原遞呈等［3］。目前有研究表明TNF-α與腦損傷后的繼發(fā)性缺血關(guān)系密切［4，5］，然而腦外傷后小鼠海馬的TNF-α表達(dá)情況尚不清楚。本研究擬通過自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型，探討腦外傷后小鼠海馬TNF-α的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

羊抗小鼠 TNF-α（Sigma公司），兔抗羊 IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），S-P免疫組化染色試劑盒與DAB顯色試劑盒（福州邁新），高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（Olympus公司），Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司）。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組

Balb/c系雄性小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組（30只）和腦外傷組（30只）。采用改良的自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型，打擊裝置由腦立體定向儀、垂直導(dǎo)管、下落砝碼、頂端涂有聚乙烯的撞針組成、撞針底端直徑3 mm，異氟烷吸入麻醉小鼠后，將頭部固定于腦立體定向儀上，消毒，沿中線切開頭皮，暴露頭蓋骨，分離骨膜，將撞針置于前、后囟門中點(diǎn)偏左1 mm，以40 g砝碼從25 cm高處沿垂直導(dǎo)管自由下落，撞擊撞針造成腦損傷，縫合頭皮，給予充足水和食物喂養(yǎng)，假手術(shù)對(duì)照組僅切開頭皮暴露顱骨，不實(shí)施打擊。

腦外傷后，根據(jù)小鼠腦損傷NSS評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分：?jiǎn)蝹?cè)或雙側(cè)偏癱（1分），無法于3 cm平衡木上行走（1分），無法在2 cm平衡木上行走（1分），無法在1 cm平衡木上行走（1分），無法在0.5 cm平衡木上站穩(wěn)（1分），無法在直徑0.5 cm平衡木上站穩(wěn)（1分），2 d內(nèi)無法走出直徑30 cm圓圈（1分），不能走直線（1分），驚嚇反射消失（1分），探尋反射消失（1分），總分10分。重度損傷為7～8分，中度損傷為5～6分，輕度損傷為4分。

本研究篩選7～8分重度腦外傷小鼠作為研究對(duì)象。其中腦外傷組按 6 h、1 d、3 d［4］各選取 8 只，隨機(jī)分配進(jìn)行免疫組化、Western blot和RT-PCR檢測(cè)；假手術(shù)組也按照6 h、1 d、3 d時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)抽取8只分配后行上述檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：取各組小鼠分別于假手術(shù)、腦損傷后 6 h、1 d，3 d，以 0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，固定，斷頭取腦置于4%多聚甲醛后固定12 h，移入30%蔗糖溶液至沉淀。乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作連續(xù)冠狀腦切片，切片厚8 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，按S-P試劑盒說明書測(cè)定TNF-α的表達(dá)。

1.3.2 Western blot：各組小鼠以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，冰上斷頭取海馬，超聲粉碎，離心取上清，以考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法測(cè)定樣品蛋白含量，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)印，雜交，暗室內(nèi)ECL反應(yīng)，X線片顯影、定影，凝膠圖像分析儀采集分析光密度值（mean optical density，MOD），TNF-α 蛋白的 MOD 與內(nèi)參照β-actin的MOD比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 RT-PCR：麻醉處死各組小鼠，冰上斷頭取海馬，按RNAout說明書進(jìn)行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄（RT法）先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增；TNF-α 上游引物：5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′；下游引物：5′-GGATGAACACG CCAGTCGCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng) 255 bp；β-actin 的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物：5′-GCGGGGCA TCGGAACCGCTCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)374 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。用目的基因與β-actin光密度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±s表示，各組比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

結(jié)果顯示，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達(dá)腦外傷6 h迅速升高，為0.25±0.08；1 d時(shí)的表達(dá)量最高，為0.59±0.23；3 d 時(shí)表達(dá)已降低，為 0.47±0.21；腦外傷組各時(shí)間點(diǎn)（6 h、1 d、3 d）TNF-α 蛋白表達(dá)與假手術(shù)組（各時(shí)點(diǎn)分別為 0.11±0.02，0.13±0.05，0.14±0.03）比較均顯著升高（P<0.05，圖1）。

2.2 Western blot結(jié)果

根據(jù)蛋白免疫印跡結(jié)果可以看出，在小鼠腦外傷后6 h，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達(dá)迅速升高，相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.06；到1 d時(shí)，TNF-α蛋白的表達(dá)量最高（0.69±0.31），到 3 d時(shí)，TNF-α 蛋白的表達(dá)已降低（0.57±0.28）；腦外傷組各時(shí)間點(diǎn)（6 h、1 d、3 d）TNF-α蛋白的表達(dá)與對(duì)應(yīng)時(shí)間假手術(shù)組（0.17±0.03，0.20±0.05，0.17±0.04）比較均顯著升高（P<0.05，圖 2）。

2.3 RT-PCR結(jié)果

小鼠腦外傷6 h相對(duì)表達(dá)量為0.43±0.21，1 d的相對(duì)表達(dá)量為0.82±0.15，3 d的相對(duì)表達(dá)量為0.63±0.27，均比假手術(shù)組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量（0.30±0.09，0.34±0.12，0.29±0.11）顯著升高（P<0.05，圖 3）。

3 討論

顱腦損傷后血腦屏障受損，影響腦的正常代謝，自由基產(chǎn)生增多、胞質(zhì)鈣離子超載、中樞神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，加劇了繼發(fā)性損害，引起腦缺血缺氧及腦水腫［6，7］。近幾年顱腦損傷的研究進(jìn)展主要集中在腦組織損傷后繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損害，尤其是顱腦損傷后的缺血缺氧性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是介導(dǎo)腦缺血性損傷的主要遞質(zhì)之一，也是腦創(chuàng)傷后血管源性腦水腫形成的重要原因［8，9］。

本研究利用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測(cè)腦外傷小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在腦外傷后6 h后，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達(dá)迅速升高，到1 d時(shí)，TNF-α蛋白的表達(dá)量最高，到3 d時(shí)，TNF-α蛋白的表達(dá)已開始降低。用RT-PCR方法對(duì)腦外傷小鼠海馬的TNF-αmRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6 h組小鼠TNF-αmRNA表達(dá)量已顯著升高，1 d時(shí)表達(dá)量最高，到3 d時(shí)略有降低。以上結(jié)果提示，TNF-α作為機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要因子，在閉合性顱腦損傷后小鼠海馬的表達(dá)顯著升高，可能參與了海馬繼發(fā)性缺血缺氧等病理生理過程，從而加重神經(jīng)元損傷，甚至遲發(fā)性神經(jīng)元死亡等［10］。TNF-α可能由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞甚至肥大細(xì)胞等產(chǎn)生和釋放，改變血腦屏障的通透性，加重炎性反應(yīng)和組織水腫，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［9］。由于腦組織內(nèi)大量存在腫瘤壞死因子受體，TNF-α表達(dá)升高后，可以廣泛作用于腦組織，并參與多種繼發(fā)性病理生理反應(yīng)，導(dǎo)致局部和廣泛性的腦組織二次損害。

腦外傷是成年人致死和致殘的重要原因，因此對(duì)腦損傷進(jìn)行深入研究對(duì)臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)都具有現(xiàn)實(shí)意義。90%創(chuàng)傷性腦損傷死亡患者都有缺血性改變，是繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制。海馬是腦內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是對(duì)原發(fā)腦損傷和繼發(fā)腦缺血非常敏感的區(qū)域。本研究結(jié)果顯示腦損傷后小鼠海馬TNF-α表達(dá)明顯升高，提示其可能與海馬的繼發(fā)性缺血損傷有密切關(guān)系。

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