郭夏麗，楊小麗，王 巖

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001)

0 引言

在秸稈的資源化和能源化利用中生物法被廣泛應(yīng)用［1-3］，而在玉米秸稈的微生物降解中，大多采用的是單菌株法［4-5］.由于玉米秸稈含有纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等多種組分，因此玉米秸稈的完全降解，需要多種微生物共同參與［6］.目前有一些研究者開始利用復(fù)合菌進行秸稈降解，但只注重菌種種類，缺乏考慮菌種間的協(xié)同性和分泌酶系的全面性［7］.

筆者將誘變得到的高效纖維素降解菌Y11-4與篩選得到的纖維素降解菌X2、木質(zhì)素降解菌L3及酵母菌J6進行組配，然后將由單菌株組合的菌系與馴化得到的降解菌系再次組合，形成秸稈降解的復(fù)合菌劑.通過考察玉米秸稈降解體系的pH值變化、微生物組成、酶組成、秸稈降解率等，以檢驗秸稈降解復(fù)合菌劑的穩(wěn)定性、酶系組成的全面性及其對秸稈的降解效果.

1 材料與方法

1.1 秸稈處理

將風干的玉米秸稈剪成長約1 cm的小塊，于105℃烘1 h，冷卻后稱取4 g添加到150 mL三角瓶中，再加入12 mL營養(yǎng)液，混合均勻，于121℃滅菌40 min作秸稈降解率測定培養(yǎng)基.

無機鹽溶液：MgSO4.7H2O 5 g，CaCl20.1 g，KH2PO41 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.05 g，Zn-SO4.7H2O 0.014 g，MnSO4.7H2O 0.016 g，CoCl20.01 g，水1 000 mL，pH值自然.

營養(yǎng)液：(NH4)2SO46 g，尿素 3 g，蛋白胨3 g，無機鹽溶液1 000 mL，pH值自然.

1.2 菌劑降解性能測定

將復(fù)合菌劑接種于秸稈培養(yǎng)基，于30℃靜止培養(yǎng)14 d，每天定時振蕩一次，在一定時間間隔內(nèi)分別測定pH值、酶活性、微生物數(shù)量及秸稈降解率［8-9］.

酶活測定.外切型葡聚糖酶(C1)活測定：取兩支25 mL試管，各加0.2 mL酶液，再加pH為4.8的醋酸緩沖液1.8 mL，測定管加入50 mg脫脂棉，充分浸泡，與不加脫脂棉的空白管同時置50℃恒溫水浴60 min.然后分別加入DNS顯色液2 mL，空白管同時加50 mg脫脂棉，沸水浴10 min，冷卻后加水至15 mL，混勻，在550 nm處比色.羧甲基纖維素酶(Cx)活測定：取兩支25 mL試管，各加0.2 mL酶液，測定管加1.8 mL羧甲基纖維素鈉CMC(1 g/100 mL)，空白管加pH為4.8醋酸緩沖液1.8 mL，置50℃恒溫水浴60 min，取出，加入2 mL DNS溶液，沸水浴中保持10 min，冷卻后加水至15 mL，混勻，在550 nm處比色.β-葡萄糖苷酶(Cb)酶活測定：把CMC酶活測定中的 CMC(1 g/100 mL)換成水楊素(1 g/100 mL).

纖維素酶活定義：1 mL酶液于50℃，pH4.8條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量即為1個酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 秸稈降解體系pH的變化

秸稈降解菌系的pH調(diào)控能力是其穩(wěn)定性的重要表現(xiàn)之一，通過對秸稈降解過程中pH變化的檢測，來探明復(fù)合菌系的穩(wěn)定性.不同培養(yǎng)時間pH的變化如圖1所示.

圖1 不同培養(yǎng)時間pH的變化Fig.1 The pH changes at different culture time

由圖1可知，在秸稈降解的14 d內(nèi)，體系的pH值始終處于6.5～7.5之間.在整個降解過程中體系的pH值始終變化不大，處于中性范圍內(nèi)，而且秸稈降解率逐漸增加，表明穩(wěn)定的pH提供了微生物生長及代謝活動旺盛進行所需要的適宜環(huán)境，從而使微生物能高效降解秸稈.pH的穩(wěn)定說明該復(fù)合菌系具有一定的pH調(diào)節(jié)能力.

2.2 秸稈降解過程中纖維素降解酶活性的變化

纖維素的降解是秸稈降解的關(guān)鍵.纖維素的降解是內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(Cx酶)，外切 β-1，4-葡聚糖酶(C1酶)和β-葡萄糖苷酶(Cb酶)協(xié)同作用的結(jié)果［10］，本研究通過考察秸稈降解過程中各種纖維素降解酶的活性變化，以探明復(fù)合菌劑產(chǎn)生的纖維素降解酶的種類及其在玉米秸稈降解中的作用.

秸稈降解過程中纖維素酶活力的變化如圖2所示.由圖2可以看出，復(fù)合菌劑能夠分泌纖維素降解所需的3種酶類，在秸稈降解的整個過程中，各纖維素酶活性變化呈現(xiàn)了一個由低到高、再回落的趨勢.纖維素降解酶為纖維素底物誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶.在培養(yǎng)前期，復(fù)合菌系中各種纖維素降解菌開始被誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素降解酶，因而酶活逐漸增大，隨著底物秸稈的不斷降解，纖維素濃度逐漸降低，導(dǎo)致纖維素降解酶活有所降低.C1酶和Cx酶的水解產(chǎn)物纖維二糖對C1酶和Cx酶具有很強的反饋抑制作用［11］，而Cb酶可水解纖維二糖，從而解除該抑制作用.由圖2可知，Cb酶在C1酶和Cx酶之前進入高活性階段，對C1酶和Cx酶的活性增加起到了促進作用.Cx酶的作用可以形成C1酶所需要的游離末端，Cx酶在C1酶之前進入高活性階段，對C1酶的活性具有一定促進作用.C1酶、Cx酶和Cb酶表現(xiàn)了良好的協(xié)同性.C1酶、Cx酶和Cb酶是由混合菌系產(chǎn)生分泌的，可以來自不同的菌源，這3種酶間的協(xié)同性在一定程度上反映了復(fù)合菌系在秸稈降解功能上的穩(wěn)定性.

圖2 秸稈降解過程中纖維素酶活力的變化Fig.2 The cellulase activity at different culture time

2.3 秸稈降解率及微生物種群的變化

復(fù)合菌系中不同微生物種群之間的協(xié)同作用是復(fù)合菌系穩(wěn)定的關(guān)鍵.通過分析秸稈降解過程中不同微生物種群的數(shù)量變化，以探明復(fù)合菌系穩(wěn)定的根本機制.秸稈降解率及微生物種群變化如圖3所示.

圖3 秸稈降解過程中微生物組成的變化Fig.3 The changes of microbial populations during corn stalk decomposing

由圖3可知，秸稈降解率在前6 d增加較快，隨后變得緩慢.細菌數(shù)量隨著秸稈的降解一直增加，到第10 d趨于穩(wěn)定.真菌數(shù)量在前8 d逐漸增加，隨后有一定的下降，并在第10 d保持穩(wěn)定.本研究的前期工作即纖維素分解菌的篩選表明真菌分泌的胞外纖維素酶活比細菌的活性高［12］，而且真菌具有發(fā)達的菌絲，菌絲能很快覆蓋秸稈表面，有利于秸稈降解，加之，真菌數(shù)量與C1酶和Cx酶活均在第8 d達到最高，說明C1酶和Cx酶大多來自真菌，表明真菌直接參與了秸稈降解過程.細菌雖然纖維素酶活不高，但能利用纖維素水解產(chǎn)物葡萄糖和纖維二糖，憑借其快速生長繁殖優(yōu)勢，消耗大量的葡萄糖和纖維二糖，在一定程度上緩解纖維素分解產(chǎn)物對真菌纖維素分解酶的反饋抑制，間接促進秸稈降解.再者，細菌適宜pH為中性，而秸稈降解體系的pH值始終處于6.5～7.5之間，推測細菌在pH的調(diào)控上起主導(dǎo)作用.

3 結(jié)論

(1)在秸稈的整個降解過程中，pH值一直處于中性范圍，表明秸稈降解菌劑對pH具有較強的調(diào)節(jié)能力，在性質(zhì)上具有穩(wěn)定性.

(2)復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生纖維素降解所需的三種酶類，即C1酶、Cx酶和Cb酶.在秸稈降解過程中，Cb酶對C1酶和Cx酶的活性有促進作用，Cx酶對C1酶的活性有促進作用.C1酶、Cx酶和Cb酶之間具有一定協(xié)同性.

(3)復(fù)合菌劑主要由細菌和真菌組成.在秸稈降解過程中，真菌通過產(chǎn)生纖維素酶降解秸稈，同時為細菌提供了大量營養(yǎng)物質(zhì);而細菌通過利用纖維素降解產(chǎn)物——葡萄糖和纖維二糖進行生長繁殖，解除真菌的產(chǎn)物反饋抑制作用，間接促進了秸稈的降解.細菌群落與真菌群落的協(xié)同作用是復(fù)合菌系穩(wěn)定性的基礎(chǔ).

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