張曙光，王俊平，生 威，張 燕，王 碩

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

中藥中速滅威殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

張曙光，王俊平，生 威，張 燕，王 碩

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定金銀花、枸杞、人參、板藍(lán)根、大青葉和圓弧止痛片為代表的中藥中速滅威的殘留量．金銀花等經(jīng)過(guò)粉碎，加入甲醇提取、旋蒸、PBS復(fù)溶等簡(jiǎn)單前處理之后，再經(jīng)過(guò)適度的稀釋可以達(dá)到消除基質(zhì)影響，用ELISA進(jìn)行測(cè)定．中藥樣品添加回收率為64.00%～91.30%，變異系數(shù)均小于30.12%．結(jié)果表明，該方法可以簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出金銀花、枸杞、人參、板藍(lán)根、大青葉和圓弧止痛片等中藥中速滅威的殘留量.關(guān)鍵詞：ELISA；中藥；速滅威；檢測(cè)

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑及儀器

金銀花(Lonicera chrysantha)、枸杞(Lycium chinense)、人參(Radix Ginseng)、板藍(lán)根(Radix Isatidis)、大青葉(Folium Isatidis)、元胡止痛片(Yuanhu painkillers)，天津市塘沽區(qū)某藥店；速滅威標(biāo)準(zhǔn)品、吐溫20、3，3'，5，5'–四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，美國(guó)Sigma公司；小牛血清蛋白(BSA)，Merck 公司；速滅威抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)酶標(biāo)抗原，天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室．

酶標(biāo)儀，Thermo 公司；單道、8道微量可調(diào)移液器，Gilson 公司；渦旋混合器，北方同正公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；442404酶標(biāo)板，NUNC公司．

1.2 直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的建立

包被：抗體每孔1,μg包被在酶標(biāo)板上，室溫孵育過(guò)夜或37,℃孵育3,h，PBST洗板3次．

封閉：用封閉液(每孔200, μL，1%BSA)室溫封閉1,h，然后棄去封閉液，PBST洗板3次．

酶標(biāo)抗原和標(biāo)樣(或樣品提取液)：每孔先加入100,μL速滅威標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品提取稀釋液，再加入100,μL適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗原，以不加速滅威標(biāo)樣的孔為對(duì)照．室溫孵育1,h，PBST洗板4次．

顯色：在每個(gè)孔中加入150,μL顯色液3，3'，5，5'–四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行顯色，加入底物溶液后，底物在酶作用下水解成色，室溫下反應(yīng)20,min，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原(抗體)的量成正比．

終止反應(yīng)：在每孔中加入50,μL終止液，終止反應(yīng)．

測(cè)定吸光度：在雙波長(zhǎng)方式(450,nm為測(cè)定波長(zhǎng)，650,nm為參考波長(zhǎng))下，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A).

計(jì)算不同濃度的速滅威對(duì)抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合的抑制率．

以抑制率為縱坐標(biāo)，速滅威標(biāo)品質(zhì)量濃度(ρ，單位為ng/mL)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出靈敏度即抑制終濃度(IC50)和最低檢出限(IC15)．

1.3 樣品的前處理

對(duì)6種樣品進(jìn)行樣品基質(zhì)影響和消除的研究，經(jīng)檢測(cè)不含有速滅威農(nóng)藥．加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，向各樣品中分別添加50、100、200,μg/kg的速滅威標(biāo)準(zhǔn)品，將加標(biāo)樣品充分混勻，稱取1,g樣品，用10,mL有機(jī)溶劑提取，渦旋振蕩5,min后，5,000,r/min離心5,min，吸取上清液，過(guò)0.22,μm的有機(jī)膜．將上述過(guò)膜后的液體用PBS稀釋不同的倍數(shù)，并添加吐溫20或BSA 或明膠作為掩蔽劑，消除基質(zhì)影響．

1.4 樣品的添加回收

所有樣品經(jīng)島津高效液相色譜儀檢測(cè)，結(jié)果均為陰性. 在這些陰性樣品中分別添加50、100、200,μg/kg的速滅威標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平作 3次平行實(shí)驗(yàn)，添加后振蕩混勻，處理后進(jìn)行直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)．

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

確定了速滅威直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)中抗體包被濃度為每孔1.0,μg，酶標(biāo)抗原稀釋度為1﹕8,000．標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖溶液從2,000,μg/L開(kāi)始5倍梯度稀釋得到6個(gè)濃度，以直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，得到不同速滅威濃度的450～650,nm吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率，繪出速滅威標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示．本法測(cè)定的速滅威靈敏度IC50為(32.9±0.50)μg/L，檢測(cè)限為(2.5±0.09)μg/L．

圖1 速滅威直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of Metolcarb competitive direct ELISA

2.2 提取溶劑的選擇

提取是農(nóng)藥殘留分析步驟中很關(guān)鍵的一步．提取溶劑的選擇與待測(cè)農(nóng)藥性質(zhì)、檢測(cè)方法及樣本種類有關(guān)[9]．根據(jù)“相似相溶”原理，應(yīng)選擇與待測(cè)農(nóng)藥極性相似的溶劑，并要求提取溶劑的沸點(diǎn)應(yīng)為40～50,℃，既能溶解待測(cè)農(nóng)藥，又不能與待測(cè)農(nóng)藥發(fā)生反應(yīng)．同時(shí)要考慮檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)的要求[10]．為提高提取效率也可以使用兩種或兩種以上的混合溶劑提取，但這無(wú)疑增多了實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)快速檢測(cè)方法無(wú)益．因此，在保證提取效率的前提下，最好選用單種有機(jī)溶劑提?。畬?duì)含水量高的樣本，要選擇與水能相混溶的溶劑，還應(yīng)考慮溶劑對(duì)樣本的滲透能力等，以便將樣本組織中的待測(cè)農(nóng)藥充分提取出來(lái)[11]．在農(nóng)藥殘留分析中，根據(jù)農(nóng)藥極性、樣本性質(zhì)等選擇不同極性的提取劑[12]，目前應(yīng)用最廣泛的溶劑是甲醇或丙酮，它們能很好地溶解大多數(shù)農(nóng)藥．但丙酮會(huì)大量提取植物組織中的油脂和色素[7,13]，對(duì)下一步的檢測(cè)帶來(lái)困難，并且會(huì)降低方法靈敏度．甲醇對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥提取率較高、效果好，本實(shí)驗(yàn)用甲醇作為提取溶劑.

2.3 基質(zhì)影響的消除

酶聯(lián)免疫技術(shù)之所以能夠在快速檢測(cè)中得到發(fā)展，主要是因?yàn)槊嘎?lián)免疫檢測(cè)方法檢測(cè)線靈敏，而且其前處理相對(duì)簡(jiǎn)單．提取后只需經(jīng)適度稀釋，必要的時(shí)候還需加合適的掩蔽劑(明膠、BSA、乳粉等)[14-15].中藥成分復(fù)雜，提取液中含有的色素、糖、植物蛋白、脂肪及提取溶劑等均能對(duì)抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生干擾，這種基質(zhì)效應(yīng)會(huì)降低標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度和方法的可靠性．本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在稀釋的基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)丶右恍┭诒蝿┘纯梢韵|(zhì)影響，使基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線重合．

以板藍(lán)根為例，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后，用總體積為1,mL的不同比例甲醇和PBS復(fù)溶，過(guò)膜后再用PBS稀釋20、50、100、200、300倍，基質(zhì)影響的消除結(jié)果如圖2所示．

圖2 不同稀釋倍數(shù)的板藍(lán)根樣品中基質(zhì)影響的消除Fig. 2 Different dilution to remove the matrix effect of Radix Isatidis

由圖2可知，稀釋300倍后基質(zhì)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合．在稀釋300倍的基礎(chǔ)上，以0.1%BSA和0.05% 吐溫20作掩蔽劑，能達(dá)到很好的基質(zhì)消除效果，如圖3所示．

圖3 速滅威直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制率曲線與吸光度曲線(n＝10)Fig. 3 Inhibition ratio curve and absorbance curve of competitive direct ELISA Metolcarb(n＝10)

板藍(lán)根的基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率曲線和吸光度值曲線幾乎完全重合，基質(zhì)影響基本消除．其他中藥同上述方法，金銀花、枸杞、人參、大青葉和元胡止痛片的稀釋倍數(shù)分別是200、100、300、400、400倍；其中金銀花、枸杞用0.5%的明膠和0.05%的吐溫，大青葉、人參用0.1%的BSA和0.05%的吐溫，元胡止痛片用0.3%的BSA和0.05%的吐溫分別作為掩蔽劑，可以使標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值曲線完全重合．由于沒(méi)有太多相關(guān)的限定標(biāo)準(zhǔn)，稀釋后的靈敏度仍能滿足檢測(cè)的要求．

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

在不同中藥樣品中分別添加不同含量的速滅威，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)計(jì)算回收率，每個(gè)水平作 3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1．由表1可知，直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的回收率在64.00%～91.30%之間，變異系數(shù)小于30.12%．

表1 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA添加回收實(shí)驗(yàn)(n＝3)Tab. 1 Recovery test in ELISA(n=,3)

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究建立了對(duì)中藥中速滅威殘留量的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法．該方法樣品處理簡(jiǎn)單，只需經(jīng)適度稀釋就能達(dá)到消除基質(zhì)的目的，并且與國(guó)內(nèi)及日本肯定列表規(guī)定的其他食品的限定標(biāo)準(zhǔn)相一致，靈敏度仍能滿足檢測(cè)要求．此法有開(kāi)發(fā)成商品試劑盒的潛力．

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責(zé)任編輯：郎婧

Metolcarb Residue Analysis Using ELISA in Chinese Herbal Medicines

ZHANG Shuguang，WANG Junping，SHENG Wei，ZHANG Yan，WANG Shuo
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

A direct competitive ELISA was established in detecting Metolcarb residues in Chinese herbal medicines，such as Lonicera chrysantha，Lycium chinense，Radix Ginseng，Radix Isatidis，F(xiàn)olium Isatidis and Yuanhu painkillers. After Lonicera chrysantha and so on were mashed and homogenized，methanolextraction, rotary steaming，and PBS were used to make up to volume. Moderate dilution then could eliminate the influence of matrix，which was detected by ELISA. In Chinese herbal medicines，the recovery rate was 66%-91%，with variation coefficient less than 30%. The method is simple，quick，sensitive and accurate in detecting the Metolcarb residues in Chinese herbal medicines.

ELISA；Chinese herbal medicines；Metolcarb；determination

R932

A

1672-6510(2012)03-0021-04

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥在世界范圍內(nèi)的防病和治病作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，但中藥卻不為國(guó)際承認(rèn)，主要原因在于中國(guó)的中藥及其制劑缺乏完備合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，包括中藥及其制劑有效成分質(zhì)與量的控制以及中藥材及其制劑中有毒、有害成分(雜質(zhì))的種類和量值控制[1]．而且野生藥材資源日漸枯竭，人們將許多中藥進(jìn)行人工種植．在種植過(guò)程中為了提高產(chǎn)量而廣泛使用農(nóng)藥，隨之帶來(lái)中藥材農(nóng)藥殘留問(wèn)題，使藥材質(zhì)量受到影響[2]．

現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中化學(xué)農(nóng)藥的殘留分析大多采用儀器分析法、生物測(cè)定和生化測(cè)定法[3–4]，我國(guó)目前進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)最常用的手段有高效液相色譜法(HPLC)[5–6]、氣相色譜法(GC)[7]、液–質(zhì)聯(lián)用(HPLC/MS)和氣–質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)等[2].液相色譜法檢測(cè)多種農(nóng)藥易出現(xiàn)某些待測(cè)組分因分離效果不佳而可能導(dǎo)致的定性困難的缺點(diǎn)，氣相色譜質(zhì)譜法則成本較高[8]，而且儀器分析因其繁復(fù)的前處理使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)受到限制．酶聯(lián)免疫學(xué)法檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、成本低廉、簡(jiǎn)便快捷、樣品容量大、時(shí)間短．國(guó)內(nèi)外用酶聯(lián)免疫學(xué)法或酶免技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法檢測(cè)食品中的速滅威殘留的相關(guān)報(bào)道甚多，而對(duì)中藥材的檢測(cè)分析卻未有文獻(xiàn)報(bào)道．因此，本研究建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(ELISA)，測(cè)定金銀花、枸杞、人參、板藍(lán)根、大青葉和圓弧止痛片為代表的中藥中農(nóng)藥速滅威的殘留量．

2011-12-25；

2012-03-13

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題(2009ZX09502-027)

張曙光（1986—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王 碩，教授，s.wang@tust.edu.cn.