王洪星 ，張雨良 ，羅志文 ，楊文君 ，劉志昕

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，儋州571737）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外擴(kuò)增DNA的一種技術(shù)，其能夠在短時(shí)間內(nèi)根據(jù)極微量的模板序列擴(kuò)增出大量特異性DNA片斷，擴(kuò)增過程類似于核裂變。Mullis博士在1983年發(fā)明了該技術(shù)，PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)中最有價(jià)值的技術(shù)之一（David Clark，2005），隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展其又衍生出多種類型的相關(guān)技術(shù)，包括差異顯示PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、巢式PCR、多重PCR和不對稱PCR等（薩姆布魯克，2002）。

PCR方法的廣泛應(yīng)用及其相關(guān)技術(shù)的順利進(jìn)行均離不開PCR引物的合理設(shè)計(jì)?？梢哉f，PCR引物的合理設(shè)計(jì)是任何PCR反應(yīng)能否進(jìn)行及其產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)率高低的關(guān)鍵。目前許多計(jì)算機(jī)軟件如Primer Premier 3.0，Primer Premier 5.0，Oligo 6.0等均可用于引物的設(shè)計(jì)。但由于軟件自身存在的局限性，其設(shè)計(jì)的引物并無法滿足實(shí)驗(yàn)者不同需要。目前最常用的是計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，即實(shí)驗(yàn)者根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的原則并結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)人工設(shè)計(jì)引物，然后選擇合適的軟件分析引物的合理性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及軟件

實(shí)驗(yàn)用甘蔗樣品采自海南兩院甘蔗種植基地。 Trizol（Invitrongen），SYBR Green supermix（TaKaRa）、RTPCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程（大連）有限公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒（上海生物工程有限公司），反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司，其它藥品為國產(chǎn)分析純。Primer Premier 5.0、Oligo6.0、DNAMAN等軟件于http://www.bio-soft.net下載。

1.2 甘蔗總RNA提取和RT-PCR

從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織，以TRIzol法（余愛麗，2004）得到較理想的RNA樣品。提取的總RNA溶解于100μL dd H2O中，取4μL RNA溶液稀釋200倍，采用UV-760紫外分光光度計(jì)測量260nm、280nm的OD值，計(jì)算OD260／280的比值并用1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳在約5V/cm的電壓下，快速電泳檢測并照相。

以所提取的總RNA為模板，利用寶生物工程 （大連）有限公司SuperScript III反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行，PCR反應(yīng)按全式金公司TaqDNA聚合酶操作說明進(jìn)行，并優(yōu)化反應(yīng)程序。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)與目的序列測序

1.3.1 普通PCR引物設(shè)計(jì)與目的序列測序 根據(jù)甘蔗黃葉病毒 （ScYLV）genebank相關(guān)基因系列 （登錄號AF369923.1；AF369924.1；AF369925.1；AF369926.1；AF369927.1；AF369928.1；AF369929.1；AF141385.1；AF141385.1）、 高粱花葉病毒 （SrMV） 相關(guān)基因序列 （登錄 號：NC_004035.1；DQ530434.1；U57358.2；AY648298.1）通過DNAMAN軟件比對，找出保守序列，綜合考慮引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則，運(yùn)用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)，使引物序列G+C含量介于45%～60%，引物長度介于18～25bp，目的片段介于400～1000 bp（見表1）。

對PCR的各引物濃度及反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出不同病毒PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)模式。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳；切膠后用回收目的片段，克隆于pMD18-T載體，送上海生物工程公司測序。

1.3.2 多重PCR引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增 利用上述結(jié)果，結(jié)合考慮多重PCR引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則，運(yùn)用Primer Premier 5.0和Oligo6.0進(jìn)行引物驗(yàn)證，以挑選出一對特異引物（表1）。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì) 綜合考慮多重PCR引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則， 運(yùn)用 Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)。對PCR的各引物濃度及反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)模式（表2）。切膠回收，測序；連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，稀釋10倍，利用SYBR Green I熒光染料法做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 用于實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的引物特征

1.4 帶有酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)與目的序列測序

根據(jù)ScYLV相關(guān)基因 （登錄號AY23679.1、GU190159.1、HM640267、AF157029.1、AF369927.1、GU190159.1、AF157029.1、AM072750.1、AY236971.1、GU570006.1），綜合考慮酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則，運(yùn)用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出克隆Coat Protein（CP）基因和P0蛋白基因的引物（表3）。

對PCR的各引物濃度及反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出不同基因片段PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)模式。切膠回收、雙酶切，連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，雙酶切質(zhì)粒，凝膠電泳，回收目的片段，再送檢測序。

表3 用于擴(kuò)增ScYLV相關(guān)序列的帶酶切位點(diǎn)的引物特征

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本總RNA電泳結(jié)果

用TRIzol法分別從感病植株葉片中提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示各條帶清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象，RNA具有較好的完整性（圖1）。

圖1 Trizol法提取甘蔗病葉總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 PCR引物效果檢測

2.2.1 普通PCR引物效果檢測 所設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增效率高、特異性好、電泳結(jié)果呈單一亮帶，且各引物無特異性條帶，引物設(shè)計(jì)成功。ScYLV和SrMV均見特異性反應(yīng)條帶，經(jīng)測序，1～5的條帶大小依次為：833、470、591、400、346 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小相同（圖 2）。

圖2 引物特異性試驗(yàn)

圖3 多重RT-PCR特異性試驗(yàn)

2.2.2 多重PCR引物設(shè)計(jì)效果檢測 特異性試驗(yàn)ScYLV和SrMV均見特異性反應(yīng)條帶，而且引物之間與模板之間也未產(chǎn)生明顯的相互干擾，引物設(shè)計(jì)成功。經(jīng)測序，序列大小分別為346和833bp，與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小相同（圖3）。

2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)效果檢測 試驗(yàn)以制備的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品 （濃度分別為 108、107、106、105、104、103、102、101）采用10倍濃度的梯度稀釋。通過梯度稀釋樣本的設(shè)置，用擴(kuò)增曲線達(dá)到域值時(shí)的反應(yīng)循環(huán)數(shù)（Ct值）做回歸曲線，結(jié)果如圖4：可以得到較理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好 （R2=0.988），擴(kuò)增效率為99.8%，引物設(shè)計(jì)成功，可以定量檢測ScYLV。

圖4 ScYLV熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 PMD-19重組質(zhì)粒的酶切圖譜

2.3 帶有酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)效果檢測

PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后的電泳結(jié)果 （圖5）表明，所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增效率高、特異性好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。ScYLV CP、P0可以順利克隆表達(dá)，經(jīng)測序，條帶大小分別為591 bp和771 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小相同，均成功連有酶切位點(diǎn)，經(jīng)蛋白分析后，CP基因在表達(dá)載體中表達(dá)出來的融合蛋白大約43kD；P0基因在表達(dá)載體中表達(dá)出來的融合蛋白大約51 kD。

3 討論

PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對合適的寡核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性成功與否。設(shè)計(jì)PCR引物，首先要解決引物評估問題，即回答什么是合適的引物，以及這些引物的相互干擾是否在可接受的范圍內(nèi)。PCR引物設(shè)計(jì)問題中要考慮的生物參數(shù)分為兩部分：首先是先確定單個(gè)引物的約束參數(shù)，據(jù)此可以區(qū)分引物的優(yōu)劣；其次是根據(jù)不同PCR的要求確定引物間的約束參數(shù)，據(jù)此來評價(jià)引物之間的干擾是否在可接受的范圍內(nèi)。

表4 單條引物約束參數(shù)

3.1 普通PCR引物的約束參數(shù)

根據(jù)對文獻(xiàn)的總結(jié)，對單個(gè)引物考慮了如下 11個(gè)約束條件 （表 4）： 引物長度（Abdelsalam.K.,2003 ）、Tm 值（SantaLucia.J.Jr.,1998）、引物 GC 含量（Dieffenbach.C.W.等，1993）、引物自身二聚體、二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)、寡核苷酸長度、3'端穩(wěn)定性（Steven.Rozen，2007）、GC 夾（F.John.Burpo，2001）、3'端自互補(bǔ)、互補(bǔ)性、特異性（Lin.W.M.，1993）。

3.2 多重PCR的引物約束參數(shù)

在多重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，是影響多重PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。在多重PCR反應(yīng)中，單條引物的長度最好介于18～24 bp，引物太長，容易導(dǎo)致引物之間相互纏繞，嚴(yán)重影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果。同時(shí)，為了避免引物的非特異性擴(kuò)增，引物必須高度特異。此外，要充分考慮到不同引物對之間互補(bǔ)的堿基序列，特別是引物間引物二聚體的形成，這將嚴(yán)重影響到引物的有效性。所有的引物對最好有相近的退火溫度，引物的堿基構(gòu)成最好是4種堿基的比例相當(dāng)，G+C的含量最好介于40%～60%。如果可能的話，引物的序列以1～2個(gè)GC開頭或結(jié)尾，避免3'端以A結(jié)尾。將引物設(shè)計(jì)好后，設(shè)計(jì)的引物序列應(yīng)該與數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行比對。如果擴(kuò)增位點(diǎn)非常相似，存在著交叉反應(yīng)，那么在引物的3'末端至少有1～2個(gè)特異性的堿基用于目的基因的特異性擴(kuò)增。在多重PCR反應(yīng)中，引物的濃度影響著多重PCR反應(yīng)的結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果證明，太高的引物濃度或者太低的引物濃度在多重PCR的反應(yīng)中都應(yīng)該避免（Henegariu.O.，1997）。太高的引物濃度或許抑制了多重的反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)太低的引物濃度很可能是無效的。

根據(jù)（Peter.M.V，2004）對多個(gè)引物之間，以及引物對，考慮了如下7個(gè)約束條件（表5）：引物長度差、退火溫度差、引物間3'端互補(bǔ)、產(chǎn)物長度、產(chǎn)物間長度差、引物間互補(bǔ)、特異性。

表5 用于多重PCR引物約束參數(shù)

3.3 實(shí)時(shí)定量PCR引物約束參數(shù)

對于實(shí)時(shí)定量PCR有兩種類型：（1）染料法。一般用SYBRGreenⅠ染料較為常見，其引物設(shè)計(jì)參數(shù)根據(jù)（Moravec.T，2003），引物設(shè)計(jì)的基本原則是提高擴(kuò)增的效率和檢測特異性。一般遵循以下原則（表6）。（2）熒光探針檢測法。要同時(shí)考慮引物和探針的質(zhì)量。通常先滿足普通PCR引物的設(shè)計(jì)要求，然后尋找合適的探針位置，再進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)，然后再將引物和探針之間進(jìn)行比對分析（Kalender，2008）。用于實(shí)時(shí)定量PCR探針技術(shù)指標(biāo)如表6。

表6 用于SYBR GreenⅠ染料法和探針法實(shí)時(shí)定量PCR引物約束參數(shù)

表7 帶有酶切位點(diǎn)的引物約束參數(shù)

3.4 帶有酶切位點(diǎn)的引物約束參數(shù)

對于帶有酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)，考慮了6個(gè)約束條件（表7）：酶切位點(diǎn)、目的序列、酶切位點(diǎn)的位置、酶切效率、引物長度、特異性。一般都是做基因克隆表達(dá)，除基本滿足一般的引物要求外還有更高的要求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定需要擴(kuò)增的DNA序列，并知道其CDS區(qū)序列（編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū)，即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)）可登陸NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢。

3.5 影響引物設(shè)計(jì)成功率的因素

引物設(shè)計(jì)的優(yōu)劣，是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。有些引物反應(yīng)性能差，可以通過反應(yīng)條件優(yōu)化得到改善，但大多數(shù)情況改善的效果并不明顯，因此，預(yù)先設(shè)計(jì)反應(yīng)性能好的引物非常重要。針對引發(fā)PCR實(shí)驗(yàn)失敗的三大主要因素（Andreson.R.，2008）：（1）引物和模板結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目；（2）引物 GC 含量；（3）預(yù)期 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)主要有三：（1）特異性高：DNA模板上不存在與引物的錯配部位或錯配效率較低；（2）對引物解鏈溫度Tm值的精確估算是確定PCR反應(yīng)退火溫度的前提條件，決定著實(shí)驗(yàn)的效率和精確性（Chavali.S，2005）。因此Tm值和GC含量在適當(dāng)范圍；引物利用效率高：引物內(nèi)部和上、下游引物之間無互補(bǔ)序列；（3）引物的長度、擴(kuò)增片段長度等參數(shù)也要加以考慮。

引物設(shè)計(jì)主要借助于生物軟件，如：Primer3（Rozen.S.，2000）,Primerpremier （Singh.V.K，1998），0ligo（Rychlik.W,2007）等，但其重點(diǎn)在單引物的設(shè)計(jì)優(yōu)化上，當(dāng)中也有個(gè)別引物設(shè)計(jì)軟件考慮到了引物之間設(shè)計(jì)優(yōu)化，基于不同實(shí)驗(yàn)要求，引物設(shè)計(jì)中，由于實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，幾乎沒有某一個(gè)引物設(shè)計(jì)軟件能完美地完全滿足要求。因此利用引物設(shè)計(jì)軟件中不同技術(shù)指標(biāo)參數(shù)。再加上人為的分析和選擇因素不但可以大大提高引物設(shè)計(jì)的成功率，而且可以不必花費(fèi)太多時(shí)間和精力。經(jīng)實(shí)驗(yàn)總結(jié)可以歸納一下，主要有以下三點(diǎn)：第一，模板的因素。盡量避免選擇一些困難模板，其中有一些模板本身的GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致引物的GC含量不能控制在合適的范圍。另外還有一些模板基因家族很大或者與其DNA序列相近的基因很多，導(dǎo)致引物的PCR擴(kuò)增不特異。這些最終都造成PCR擴(kuò)增的失敗；第二，引物的篩選，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了一組引物后，經(jīng)過初次篩選得到幾對適合要求的引物，還要在初次篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)一步用Oligo6.0驗(yàn)證，然后篩選出能夠進(jìn)行特異高效PCR擴(kuò)增的引物。

選出理論上較合適的引物以后，可以有以下兩個(gè)步驟，保證引物設(shè)計(jì)的成功率：一是要將得到的一系列引物分別在Genebank中進(jìn)行回檢。也就是把每條引物在比對工具h(yuǎn)ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的blast中進(jìn)行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。一般連續(xù)10bp以上的同源有可能形成比較穩(wěn)定的錯配，特別是引物的3'端應(yīng)避免連續(xù)5～6bp的同源。二是如果以mRNA為模板設(shè)計(jì)引物時(shí)還應(yīng)注意：首先利用生物信息學(xué)的知識大致判斷外顯子與內(nèi)含子的剪接位點(diǎn) （例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENES-CAN工具或者GeneParser軟件），然后棄掉正好位于剪接位點(diǎn)的引物，實(shí)驗(yàn)證明，按照上述原則設(shè)計(jì)合成的引物和探針，得到了高擴(kuò)增效率和穩(wěn)定的檢測結(jié)果。

引物設(shè)計(jì)只是為PCR反應(yīng)提供一種可能性，實(shí)驗(yàn)中由于影響PCR實(shí)驗(yàn)的因素較多，有時(shí)需要不斷摸索條件，引物設(shè)計(jì)軟件只是一種工具，只能為PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供比較可靠的引物，加速最佳條件的摸索，最終達(dá)到成功實(shí)現(xiàn)PCR實(shí)驗(yàn)的目的。

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