李文鳳，王曉燕，黃應(yīng)昆，羅志明，尹 炯

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠 661600）

甘蔗宿根矮化病（ratoon stuning disease，RSD）是普遍存在于所有植蔗地區(qū)的一種世界性的重要病害，自1944—1945年在澳大利亞昆士蘭首次發(fā)現(xiàn)以來，已有美國、南非、毛里求斯、印度、巴西等47個國家和地區(qū)報道了該病的發(fā)生，現(xiàn)已遍布世界各蔗區(qū)[1-7]。此病害由一種寄居木質(zhì)部的較難培養(yǎng)的細菌——木質(zhì)部賴氏菌木質(zhì)部亞種 （Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）引起[8]，主要通過帶病蔗種和收獲、砍種刀具等傳播蔓延，且傳播性極強，病蔗的蔗汁稀釋至10000倍仍具有傳染力。蔗株染病后變矮，蔗莖變細，生長遲滯，宿根發(fā)株少，在干旱地區(qū)和種植感病品種的蔗區(qū)所造成的損失尤其嚴重，病害造成損失的程度隨宿根年限的增加而增加，一般減產(chǎn)10%～30%，干旱缺水時可達60%以上，還可導(dǎo)致品種退化。由于RSD無明顯的外部和內(nèi)部癥狀，病原菌難以分離、培養(yǎng)和檢測，傳統(tǒng)診斷方法極其困難，導(dǎo)致病害任意傳播、擴展蔓延，對甘蔗生產(chǎn)危害極大。

甘蔗RSD屬維管束病害，用一般的物理、化學(xué)方法難以消除，有效的防治方法是通過溫水處理法生產(chǎn)脫毒種苗用于甘蔗生產(chǎn)，已在澳大利亞、美國、巴西、古巴、南非、菲律賓及我國臺灣省等地應(yīng)用多年[1]。而摸清蔗區(qū)RSD的分布、發(fā)生危害情況，是科學(xué)有效推廣溫水脫毒健康種苗的關(guān)鍵。本研究對廣西宜州蔗區(qū)甘蔗宿根矮化病的發(fā)生和分布進行了調(diào)查和田間采樣，通過實驗室利用分子（PCR）和血清（I-ELISA）法等檢測技術(shù)進行RSD檢測，明確了宜州蔗區(qū)RSD發(fā)病狀況，為宜州蔗區(qū)推廣應(yīng)用溫水脫毒健康種苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與樣品采集

于2009年甘蔗成熟期，對廣西宜州太平、石別、思秧、六橋、廖歌、唐上、元江、同德、大嶺、大安等甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)宿根矮化病的發(fā)生和分布進行了調(diào)查和田間采樣。采樣選擇具有代表性的主栽或主推品種、旱地蔗，根據(jù)品種、植期分類，隨機取樣，共采集52個樣本。每個樣本取10條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25mL左右的甘蔗汁于50mL離心管內(nèi)充分混勻（每取一個樣品后均用清水沖洗砍刀和鉗子，再用70%的酒精消毒），放于4℃和-20℃冰箱保存待用。

1.2 I-ELISA檢測

RSD抗血清和陽性對照由澳大利亞甘蔗試驗總局 （BSES）提供，檢測方法按參考文獻［9］進行。

1.3 PCR檢測

1.3.1 引物設(shè)計 引物序列采用已報道的RSD病原細菌Lxx 16S-23S rDNA基因間隔區(qū)特異引物[10]，預(yù)期擴增片段大小為 438 bp （上游引物 Lxxl：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′； 下游引物 Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′），委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 蔗汁總DNA的提取 用改進的CTAB法提取蔗汁總DNA。每個樣品取2mL蔗汁放入離心管中，12000r/min離心10min，棄上清液；沉淀加入300μL滅菌去離子水稀釋混勻；加入600μL經(jīng)65℃預(yù)熱的2%CTAB 抽提緩沖液，65℃水浴 1h（期間每隔 20min 搖勻 1 次）；加入 600 μL 氯仿／異戊醇（24∶1）劇烈振蕩 30s，12000r/min離心10min；取上清液700μL置于新的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿／異戊醇（24∶1）溫和地混勻，12000r/min離心10min；取上清液650μL置于新的1.5mL離心管中，加入2／3體積（455μL）的異丙醇，混勻后置-20℃冰箱中沉淀4h或過夜；4℃下12000r/min離心10min；棄上清液，沉淀分別用400μL預(yù)冷的70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次；室溫下風(fēng)干，溶于30μL雙蒸水中（用手指輕彈離心管使沉淀充分懸?。?20℃保存。

1.3.3 PCR擴增和結(jié)果判別 以抽提的蔗汁總DNA為模版，采用天根生化科技 （北京）有限公司的Taq PCR MasterMix進行 PCR 擴增。 擴增體系 20μL：ddH2O 8.6μL，2×PCR Taq mix 8μL，DNA 模板 3μL，上下游引物各 0.2μL（20μg/μL）；擴增程序為：95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)后72℃延伸5min。PCR擴增結(jié)果判別：取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增到438bp條帶的為陽性，未擴出438bp條帶的為陰性；根據(jù)目的片段條帶亮度的強弱進一步判別樣品帶菌濃度的相對高低，條帶較亮的樣品為強陽性、一般的為中陽性，較弱的為弱陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)RSD發(fā)生情況

對廣西宜州太平、石別、思秧、六橋、廖歌、唐上、元江、同德、大嶺、大安10個甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)宿根矮化病的調(diào)查和檢測結(jié)果表明，宜州蔗區(qū)RSD發(fā)生普遍。采用PCR和I-ELISA法對采集的52個樣本進行RSD檢測，結(jié)果一致。52個樣品中37個呈陽性，陽性檢出率為71.15%；其中強陽性樣品15個，占28.85%；10個甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均檢測出RSD，陽性檢出率在20.00%～100%之間，檢出率最高的是元江和大安，高達100%，其次是大嶺，檢出率為85.71%（表1）。

表1 廣西宜州主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)RSD發(fā)生情況

2.2 不同品種、植期RSD發(fā)生情況

從檢測結(jié)果看，田間主栽或主推品種中桂糖94-119、臺優(yōu)、ROC16、ROC20、園林1號、贛蔗18號、桂引9號等多個品種均發(fā)病，其中尤以桂糖94-119發(fā)病最重、其次是ROC16、臺優(yōu)、ROC20等主栽品種發(fā)病嚴重；植期上1、2、3年均不同程度發(fā)病，但三者之間無明顯差異（表2）。

表2 廣西宜州甘蔗宿根矮化病(RSD)檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 田間隨機取樣檢測結(jié)果表明，廣西宜州蔗區(qū)太平、石別、思秧、六橋、廖歌、唐上、元江、同德、大嶺、大安主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均檢測出RSD，檢測的52個樣品中，有37個樣品為陽性帶菌、占71.15%，其中有15個樣品為強陽性帶菌量高、占28.85%，由此可見，RSD在宜州蔗區(qū)發(fā)生普遍；田間主栽或主推品種中桂糖94-119、臺優(yōu)、ROC16、ROC20、園林1號、贛蔗18號、桂引9號等多個品種均發(fā)病，其中尤以桂糖94-119發(fā)病最重，其次是ROC16、臺優(yōu)、ROC20等主栽品種發(fā)病嚴重；植期上1、2、3年均不同程度發(fā)病，但三者之間無明顯差異。根據(jù)甘蔗宿根矮化病檢測結(jié)果，結(jié)合我們的多年試驗結(jié)果以及國外的研究和生產(chǎn)應(yīng)用效果，在宜州蔗區(qū)生產(chǎn)推廣應(yīng)用甘蔗脫毒種苗將會獲得顯著的增產(chǎn)效果：平均單產(chǎn)可比傳統(tǒng)種植提高1.0t/667m2左右，增幅15%～30%，可有效地防治甘蔗病害，特別是RSD的傳播，是提高甘蔗產(chǎn)量，延長甘蔗宿根年限最具潛力和效能的重要措施。為此，在宜州蔗區(qū)認真組織做好甘蔗溫水脫毒種苗生產(chǎn)、繁殖、示范工作，建立甘蔗脫毒種苗生產(chǎn)與應(yīng)用推廣技術(shù)體系及相應(yīng)技術(shù)規(guī)程，在生產(chǎn)上加快推廣，使之制度化，可大幅度提高甘蔗的產(chǎn)量、延長宿根蔗年限，從而顯著提高甘蔗生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，以此解決甘蔗生產(chǎn)特別是宿根甘蔗長期以來低產(chǎn)、宿根年限短、生產(chǎn)成本高，效益差的問題。

3.2 科學(xué)布局溫水脫毒種苗示范基地。選擇與糖廠相鄰近，交通便利、排灌方便，地勢平坦，地塊土質(zhì)、肥力均較好的良繁基地30～70hm2作為甘蔗脫毒種苗示范基地一級種苗圃（明確專業(yè)技術(shù)人員負責(zé)，由管理水平較高的專業(yè)種苗大戶種植管理，提供一級脫毒種苗）；分別在各甘蔗主產(chǎn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)劃建立甘蔗脫毒種苗基地二、三級種苗圃300～700hm2（由專業(yè)種苗戶種植管理，專用于繁殖一級種苗圃提供的一級脫毒種苗），由二、三級專用種苗圃直接為大面積生產(chǎn)提供無病種苗。

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