王廷良 吳志平，2 鄭必平 談建中，3

(1蘇州大學(xué)建筑與城市環(huán)境學(xué)院，江蘇蘇州 215123; 2江蘇華佳絲綢有限公司，江蘇吳江 215227;3蘇州大學(xué)蠶桑研究所，江蘇蘇州 215123)

家蠶幼蟲期的生長發(fā)育主要受蛻皮激素和保幼激素的調(diào)節(jié)控制［1］，咽側(cè)體分泌的保幼激素主要是維持幼蟲形態(tài)，阻止幼蟲變態(tài)發(fā)育，而前胸腺分泌的蛻皮激素則是促進幼蟲蛻皮和變態(tài)，家蠶每個齡期的生長發(fā)育狀態(tài)主要由這2種激素的相對濃度決定［2－3］。為了提高蠶絲經(jīng)濟產(chǎn)量或應(yīng)用價值，許多學(xué)者就外源性保幼激素、蛻皮激素和抗保幼激素等在家蠶上的應(yīng)用進行了探索，以期通過調(diào)控家蠶生長發(fā)育來生產(chǎn)超細(xì)纖度或超粗纖度的生絲，開拓蠶絲新用途［4－6］。

抗保幼激素(Anti-juvenile hormone，AJH)是一類能引起家蠶早熟變態(tài)的咪唑類化學(xué)物質(zhì)，在家蠶幼蟲的2齡、3齡或4齡的早期使用這類化合物，均能誘導(dǎo)家蠶早熟變態(tài)獲得三眠蠶，生產(chǎn)細(xì)纖度的繭絲［7－8］。其誘導(dǎo)三眠蠶的作用機理在于抑制了咽側(cè)體產(chǎn)生保幼激素或作為阻礙劑來阻止保幼激素生物合成，或是抑制了前胸腺的活性，使體液中蛻皮激素滴度峰延遲呈現(xiàn)，從而表現(xiàn)變態(tài)蛻皮［9－10］。本試驗應(yīng)用金鹿三眠素處理4齡餉食家蠶，用十二烷基硫酸納－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜技術(shù)，就AJH處理后家蠶血液中差異表達的蛋白質(zhì)組分進行了分析與鑒定，以期在蛋白質(zhì)水平上研究抗保幼激素對家蠶發(fā)育調(diào)控的作用機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蠶品種:大造，二化性品種，由蘇州大學(xué)蠶桑研究所司馬楊虎教授提供;抗保幼激素:金鹿三眠素，由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院陸雪芳教授提供。

1.2 三眠蠶的誘導(dǎo)方法

供試家蠶品種大造在1～3齡期間按常規(guī)方法飼養(yǎng)，4齡餉食時分區(qū)處理。試驗設(shè)金鹿三眠素處理組(A)、清水對照組(CK)。抗保幼激素處理時，首先將金鹿三眠素配成質(zhì)量濃度為400 g/L的水溶液，用噴霧器均勻噴濕桑葉的正反兩面，稍晾干后于4齡餉食開始給桑，連續(xù)添食2 d。對照區(qū)用清水處理過的桑葉，連續(xù)添食2 d。添食結(jié)束后，改用常規(guī)桑葉(片葉)飼養(yǎng)，金鹿三眠素誘導(dǎo)處理組的三眠蠶率平均可達96%。

1.3 家蠶血液的采集

金鹿三眠素處理組于4齡餉食后48、72、96、120、144、168 h，清水對照組于 4 齡餉食后 48、72 h、熟蠶期等不同發(fā)育階段分別采集雌蠶血液，并置于－70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血液蛋白質(zhì)的提取

參照文獻［11］的方法提取和定量分析家蠶血液蛋白質(zhì):取上述不同時期金鹿三眠素處理組和清水對照組的雌蠶血液，加入2.5倍體積的樣品緩沖液(6 mol·L－1Urea、2 mol·L－1Thiourea、2%CHAPS、15 mmol·L－1DTT)，加液氮研磨，使血細(xì)胞充分破碎，待溶解后于4℃、14 000 r/min條件下離心20 min;棄沉淀，取上清，于4℃、14 000 r/min條件下離心30 min;取上清，加3倍丙酮在－20℃下沉淀過夜;沉淀加樣品緩沖液重懸后，取上清液蛋白質(zhì)樣品用Bradford法［11］測定蛋白質(zhì)濃度，然后分裝保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血液蛋白質(zhì)的SDS-PAGE

按照參考文獻［12］的方法，配制丙烯酰胺濃度(體積比)分別為12%的分離膠和5%的濃縮膠;分別取金鹿三眠素處理組、清水對照組血液蛋白等量樣品50μg進行SDS-PAGE;上樣后，用恒定電流進行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達凝膠底部時停止電泳;電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)染色2 h后，用脫色液脫色過夜，用掃描儀高精度掃描和比較凝膠圖譜后，將凝膠置于潔凈玻璃板上，切取差異性條帶用于質(zhì)譜分析［13］。

1.6 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切與質(zhì)譜分析

選取差異表達蛋白質(zhì)條帶，委托上海新科生命生物科技公司進行膠內(nèi)酶切及質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗保幼激素誘導(dǎo)相關(guān)血液蛋白質(zhì)的SDSPAGE分析

對金鹿三眠素處理組不同發(fā)育時期的血液蛋白質(zhì)進行了SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示，4齡餉食開始連續(xù)添食抗保幼激素后，檢測到蛋白質(zhì)群a(70 kD左右)與蛋白質(zhì)群c(30 kD左右)的表達量逐漸增加，之后含量都維持在較高的水平，其中30 kD左右蛋白質(zhì)組分的表達量最為豐富，70 kD蛋白質(zhì)組分次之，而蛋白質(zhì)群b的表達量則逐漸降低。其次，在4齡餉食后72 h(AH2)與48 h(AH1)之間檢測到了明顯差異表達蛋白的條帶，從72 h開始出現(xiàn)了條帶S1和S2，直到熟蠶時都保持著很高的表達量，但條帶S4在72 h后開始消失。

圖1 金鹿三眠素誘導(dǎo)處理后4齡蠶血液蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜

2.2 抗保幼激素誘導(dǎo)處理組與對照組血液蛋白質(zhì)SDS-PAGE比較分析

在上述分析的基礎(chǔ)上，選取幾個特殊發(fā)育階段的血液蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析，結(jié)果在用抗保幼激素(金鹿三眠素)誘導(dǎo)處理組與對照組之間檢測到了發(fā)育相關(guān)的差異表達蛋白 S1、S2、S3和S4(圖2)。其中，條帶S1和S2在處理組72 h(AH2)時開始出現(xiàn)，一直到熟蠶期都大量積累，而對照組在4齡期不存在這2個條帶，直到熟蠶期才檢測到大量積累。相似地，金鹿三眠素誘導(dǎo)處理組條帶S3的表達量也高于對照組。其次，金鹿三眠素誘導(dǎo)處理組條帶S4在72 h時(AH2)消失，而對照組(CH1、CH2)中條帶S4比較明顯，暗示差異條帶S4可能含有與維持幼蟲形態(tài)有關(guān)的蛋白質(zhì)組分，而差異條帶S1、S2、S3可能含有與家蠶變態(tài)發(fā)育(老熟結(jié)繭)調(diào)控有關(guān)的蛋白質(zhì)組分。

圖2 金鹿三眠素誘導(dǎo)處理組與對照組血液蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析圖譜

2.3 抗保幼激素誘導(dǎo)處理組與對照組血液蛋白質(zhì)差異條帶的MS分析

為研究三眠蠶血液差異性條帶的蛋白質(zhì)組分，從圖2的1DE凝膠上切取條帶S1、S2和S4(因S1、S2、和S3條帶相距太近，為便于切膠操作，明確區(qū)分條帶，故未取條帶S3)，經(jīng)膠內(nèi)酶切、質(zhì)譜鑒定及Mascot檢索進行分析，結(jié)果共獲得了82個相匹配的候選蛋白質(zhì)，剔除覆蓋率較低(小于15%)的組分后，鑒定了其中的26個蛋白質(zhì)組分，鑒定結(jié)果如表1。

表1 三眠蠶血液差異蛋白質(zhì)條帶的MS/MS鑒定結(jié)果

在差異條帶S1、S2中，鑒定得到了多種與生理代謝相關(guān)的功能蛋白質(zhì)，其中30 kD蛋白家族的組分最多(表1)。業(yè)已清楚，大部分的30 kD蛋白基因活性從5齡第3天開始上升，5齡第4天到吐絲期活性持續(xù)提高，隨后迅速下降，化蛹時完全消失，其功能可能涉及到脂肪酸的轉(zhuǎn)運、胚胎發(fā)育、細(xì)胞程序化死亡及血漿天然免疫反應(yīng)等［14］。另一組分家蠶幼蟲血清蛋白BmLSP，分子質(zhì)量約為30 kD，具有免疫、轉(zhuǎn)運與貯藏等生理功能，具有發(fā)育與組織特異性表達的特征［15］。本研究在家蠶4齡餉食時開始用抗保幼激素金鹿三眠素進行誘導(dǎo)處理，結(jié)果在4齡第3天(72 h)即檢測到了30 kD蛋白的大量表達，而對照組此時未見明顯變化。

保幼激素結(jié)合蛋白(Juvenile hormone binding protein)是存在于血淋巴和細(xì)胞內(nèi)的一種特異載體蛋白，與保幼激素結(jié)合后保護保幼激素不被酶降解，并將它運送到作用部位，參與家蠶發(fā)育的調(diào)控過程［16］。芳基貯存蛋白(Arylphorin)是一種富含苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸的蛋白［16］，在幼蟲攝食期的脂肪體中合成旺盛，分泌到血液中，化蛹時，又幾乎全部再被脂肪體攝取并積聚于脂肪體細(xì)胞的蛋白質(zhì)顆粒中，其主要功能是在幼蟲蛻皮及變態(tài)中作為主要的氨基酸供源，用于體內(nèi)組織的形成和生殖的需要［17］。

熱激蛋白25.4屬于小熱休克蛋白家族，小分子熱休克蛋白的主要功能是與其他蛋白進行相互作用，從而使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯等生命過程中的各種細(xì)胞蛋白保持穩(wěn)定。前人研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白25.4主要存在于家蠶5齡幼蟲脂肪體和血液組織中［18］，本試驗在抗保幼激素金鹿三眠素誘導(dǎo)處理組4齡蠶的血液蛋白質(zhì)中就已檢測到了熱休克蛋白25.4，說明用抗保幼激素處理的家蠶表現(xiàn)出了5齡期的性狀。

從條帶S4中鑒定得到的蛋白質(zhì)還包括了溶酶體硫醇還原酶IP30前體1型和2型，家蠶中有關(guān)這種酶的研究目前還比較少，蔡克亞等［19］分析了家蠶抗核型多角體病毒(BmNPV)抗性品系與感性品系血淋巴液蛋白質(zhì)組的差異，發(fā)現(xiàn)溶酶體硫醇還原酶IP30前體1型存在于感性品種中，而在高抗品系中沒有檢測到。本試驗中發(fā)現(xiàn)用抗保幼激素處理過的家蠶，S4條帶在處理后72 h消失，但對其功能了解尚少。

此外，從家蠶血液總蛋白中還鑒定到了其他14種蛋白(覆蓋率小于15%)，推測這些蛋白的表達量相對較低。如胰凝乳蛋白酶抑制劑(Chymotrypsin inhibitor CI-8A)、14-3-3 ε 蛋白(14-3-3 epsilon protein)、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-活化蛋白 ε多肽(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein epsilon polypeptide)、性別特異性儲藏蛋白SP1(Sex-specific storage-protein SP1)、絲氨酸蛋白酶前體(Serine protease precursor)、類絲氨酸蛋白酶(Scolexin)、類幾丁質(zhì) EN03(Chitinase-like protein EN03)、成蟲原基生長因子(Imaginal disk growth factor)、類 IDGF蛋白(IDGF like protein)、圍脂滴蛋白(Perilipin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、同源異型盒蛋白(Homeobox protein)、突觸融合蛋白(Syntaxin)、線粒體磷酸烯醇式羧激酶亞型2(Mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase isoform 2)，這些蛋白質(zhì)分別參與了不同的生理代謝。如胰凝乳蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的一種，在家蠶體內(nèi)主要對蛋白酶的活性進行調(diào)控，維持昆蟲正常的生理功能［20］;類絲氨酸蛋白酶是一種昆蟲免疫蛋白，為應(yīng)對外來細(xì)菌或病毒的入侵而在體內(nèi)產(chǎn)生的一種能引起凝血的血漿蛋白［21］;圍脂滴蛋白是脂滴相關(guān)蛋白家族的核心成員之一，是定位于脂滴表面的高磷酸化蛋白，對脂肪組織中甘油三脂代謝有雙重調(diào)節(jié)作用［22］;轉(zhuǎn)鐵蛋白是控制生物體液中自由鐵含量的鐵結(jié)合血漿糖蛋白［23］;突觸融合蛋白是參與胞吐作用的一組細(xì)胞膜結(jié)合Q-SNARE蛋白的蛋白質(zhì)家族［24］。

3 討論

用抗保幼激素類藥物處理家蠶，可使普通四眠蠶變?yōu)槿咝Q。吳金美等［25］研究認(rèn)為，KK-42應(yīng)用于家蠶4齡前期時，靶細(xì)胞器官首先是咽側(cè)體，咽側(cè)體合成活性的變化反饋到腦，使腦分泌的PTTH發(fā)生相應(yīng)變化，使得抗保幼激素處理組第3天家蠶體內(nèi)蛻皮激素的濃度降低，促使蛻皮激素高峰的延遲，而對照組此時的蛻皮激素濃度維持在一個較高的濃度。由于蛻皮激素峰值的延遲、同時保幼激素相對饋乏，兩者共同作用引起了家蠶化蛹蛻皮，從而由四眠蠶形成三眠蠶。

本試驗用抗保幼激素類物(金鹿三眠素)在4齡餉食后48 h內(nèi)對家蠶品種大造進行處理，應(yīng)用單向凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)，分析了抗保幼激素作用相關(guān)的差異蛋白質(zhì)組分，結(jié)果從血液蛋白質(zhì)的SDSPAGE中檢測到了差異表達的蛋白質(zhì)，對具有表達差異蛋白條帶進行了質(zhì)譜鑒定，結(jié)果檢測到了多種30 kD蛋白組分。一般認(rèn)為，家蠶從蟻蠶至4齡末期的血液中都檢測不到30 kD蛋白的表達，大部分的30 kD蛋白基因活性從5齡第3天開始上升，5齡第4天開始到吐絲期活性持續(xù)提高，隨后迅速下降，化蛹時完全消失［14］。通過手術(shù)摘除家蠶幼蟲咽側(cè)體，家蠶血漿中30 kD蛋白的表達量會迅速上升［14］;隨著5齡初期家蠶體內(nèi)保幼激素濃度的下降，30 kD蛋白在血漿中的濃度確有升高，由此認(rèn)為，30 kD蛋白在脂肪體內(nèi)的生物合成可能受到保幼激素的影響［14］。

本研究在家蠶4齡餉食時開始用抗保幼激素進行處理，在4齡第3天(72 h)即檢測到了30 kD蛋白的大量表達，而對照組此時未見明顯變化，推測用抗保幼激素處理4齡家蠶可能抑制了咽側(cè)體分泌保幼激素，使保幼激素濃度進入一個低水平時期，提前啟動了30 kD蛋白相關(guān)基因的表達，從而使家蠶進入變態(tài)發(fā)育階段。據(jù)此推測，30 kD蛋白可以為研究保幼激素調(diào)控基因表達提供一個模式系統(tǒng)。

條帶S1中還含有家蠶幼蟲血清蛋白BmLSP，分子質(zhì)量約為30 kD，在幼蟲脂肪體細(xì)胞內(nèi)合成，具有組織特異性，以及免疫、轉(zhuǎn)運與貯藏等生理功能。免疫和轉(zhuǎn)運功能的血清蛋白在發(fā)育過程中維持恒定的水平，而作為貯藏功能的血清蛋白隨著發(fā)育階段不同呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，為昆蟲蛻皮或變態(tài)提供能量或原料［15］。研究發(fā)現(xiàn)，BmLSP從蟻蠶開始至5齡第3天之前各個齡期食桑階段均有轉(zhuǎn)錄表達，每個齡期的初期表達量較高，在4齡眠中有微弱表達，5齡餉食后BmLSP mRNA雖有轉(zhuǎn)錄，但是轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，到第3天已檢測不出，熟蠶時完全消失，在蛹期和成蟲期也未檢測到BmLSP mRNA［15］。本研究用抗保幼激素處理后，在4齡第3天(72 h)仍檢測到BmLSP的表達，這與JH在幼蟲5齡初期的表達變化相似，推測BmLSP可能是承擔(dān)保幼功能蛋白質(zhì)中的一員［26］，但對其誘導(dǎo)家蠶早熟變態(tài)的具體作用機理還有待進一步研究。

［1］徐豫松，徐俊良.昆蟲保幼激素研究新進展［J］.中國蠶業(yè)，2001，22(1):56 －57.

［2］繆云根，江麗軍.抗保幼激素與蛻皮激素對蠶生長發(fā)育及咽側(cè)體和前胸腺超微形態(tài)的影響［J］.蠶業(yè)科學(xué)，1998，24(1):39 －43.

［3］Kinjoh T，Kaneko Y，Itoyama K，et al.Control of juvenile hormone biosynthesis inBombyx mori:cloning of the enzymes in the mevalonate pathway and assessment of their developmental expression in the corpora allata［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2007，37(8):808 －818.

［4］Tsubouchi K，Akahane T，Imai T.High strength silk fiber obtained from super finefilament of silkworm cocoon treated with bioactive substances［J］.Japan Agricultural Research Quarterly，1997，31(2):133 －136.

［5］Kamimura M，Shimura S，Kiuchi M.Simple manipulation of silkworm molting by an artificial diet containing plant－derived 20－h(huán)ydroxyecdysone［J］.Journal of Insect Biotechnology and Sericology，2003，72(3):197 －201.

［6］Kamimura M，Kiuchi M.Effects of a juvenile hormone analog，fenoxycarb，on 5th stadium larvae of the silkworm，Bombyx mori(Lepidoptera:Bombycidae) ［J］.Applied Entomology and Zoology，1998，33(2):333－338.

［7］繆云根，江麗軍.抗保幼激素的研究概況［J］.中國蠶業(yè)，1998，19(2):8－10.

［8］Gu SH，Chow Y S.Analysis of precocious metamorphosis induced by application of an imidazole derivative to early third instar larvae of the silkworm，Bombyx mori［J］.Archives of Insect Biochemistry and Physiology，1997，36:349 －361.

［9］桑野榮.抗保幼激素活性物質(zhì)研究的最新進展［J］.植物防疫，1987，41(8):32 －37.

［10］顧世紅，申屠仁華.咪唑在決定家蠶發(fā)育中的效果［J］.國外農(nóng)學(xué)—蠶業(yè)，1994，(3):30 －32.

［11］劉艷艷.家蠶幼蟲期和蛹期發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)組的研究［D］.蘇州:蘇州大學(xué)，2009.

［12］Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4 ［J］.Nature，1970，227:680 －685.

［13］劉艷艷，池旭娟，談建中，等.家蠶蟻蠶蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2008，34(4):676 －683.

［14］楊捷頻.家蠶30K蛋白的結(jié)構(gòu)功能及五齡血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］.合肥:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2011.

［15］鄧黨軍.家蠶脂肪體特異啟動子BmLSP、BmLP3的克隆、鑒定及應(yīng)用［D］.重慶:西南大學(xué)，2011.

［16］Zheng W H，Li Q J，Gong H.Juvenile hormone binding protein in the ovaries of housefly musca domestica vacina［J］.Entomologia Sinica，1994，1(4):339－345.

［17］永田昌男，小林正彥.家蠶幼蟲發(fā)育中貯藏蛋白質(zhì)的含量變化［J］.王彥文，譯.蠶學(xué)通訊，1994(1):48 －52.

［18］夏佳音.家蠶小熱休克蛋白BmHSP25.4基因的克隆、表達及其細(xì)胞定位［D］.杭州:浙江理工大學(xué)，2008.

［19］蔡克亞，陳克平，劉曉勇，等.家蠶抗BmNPV品系與感性品系血淋巴液蛋白質(zhì)組的差異分析［J］.生物工程學(xué)報，2008，24(2):285－290.

［20］趙萍.家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2008.

［21］Finnerty CM，Karplus P A，Granados R R.The insect immune protein scolexin is a novel serine proteinase homolog［J］.Protein Science，1999，8(1):242－248.

［22］張利紅，張立杰，楊公社.一種調(diào)控脂解的重要蛋白—圍脂滴蛋白(Perilipin)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006，22(12):931－934.

［23］Crichton R R，Charloteaux W M.Iron transport and storage［J］.European Journal of Biochemistry，1987，164(3):485－506.

［24］Bennett M K，García JE，Elferink L A，et al.The syntax in family of vesicular transport receptors［J］.Cell，1993，74(5):863 －873.

［25］吳金美，吳載德.三眠蠶誘導(dǎo)劑咪唑類物質(zhì)KK-42對桑蠶內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用［J］.昆蟲學(xué)報，1991，34(3):278 －282.

［26］Fuijiwara Y，Yamashita O.Purification，characterization and changes in the titer of a new larval serum protein of the silkworm，Bombyx mori［J］.Insect Biochemistry，1990，20(7):751 – 759.