阮氏茉莉 林健榮

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶絲科學(xué)系，廣東廣州 510642; 2越南蠶桑絲研究中心，越南河內(nèi) 10000)

生物體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種自由基，主要是超氧陰離子自由基(·O－2)、羥自由基(·OH)、過(guò)氧化氫(H2O2)、單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)等。這些自由基有很強(qiáng)的氧化能力，對(duì)許多生物功能分子有破壞作用。同時(shí)，生物體內(nèi)存在超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)和過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)等清除自由基的酶類(lèi)。在正常生理?xiàng)l件下，自由基不斷產(chǎn)生，同時(shí)被不斷清除，維持濃度極低的平衡狀態(tài)。H2O2能使SOD失活，CAT和POD可清除H2O2，保護(hù)SOD;超氧陰離子自由基可使CAT和POD失活，SOD可清除超氧陰離子自由基，保護(hù)CAT和POD。這3種酶組成了相互保護(hù)清除自由基的系統(tǒng)，稱(chēng)為保護(hù)酶系統(tǒng)［1］。

SOD具有清除自由基，保護(hù)機(jī)體免遭傷害的功能。從生化角度探討家蠶SOD的遺傳性及其與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，對(duì)育種工作具有重要的指導(dǎo)意義。陳田飛等［2］通過(guò)研究表明，SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御體系的重要酶類(lèi)，精液用不同冷凍方式及不同冷凍時(shí)間冷藏SOD活性不同。魏國(guó)清等［3］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種之間蠶卵SOD酶的活力相近。劉春等［4］研究表明，一代雜交種的活性值居雙親活性值中間。姜峰等［5］研究表明，家蠶5齡第4天血液中的CAT、CarE的活性均表現(xiàn)為雄蠶大于雌蠶，而SOD的活性則雌蠶大于雄蠶。

科研人員對(duì)CAT活性與家蠶經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)性也進(jìn)行了一些探索研究。陳萍等［6－7］研究了家蠶血液CAT的活性與育種中經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明:CAT活性與5齡歷期、同宮繭率無(wú)關(guān)，與全齡期、死籠繭率、普通繭率呈一定的負(fù)相關(guān)，與全繭量、繭層量、繭層率呈不顯著的正相關(guān)，與萬(wàn)頭產(chǎn)繭量、萬(wàn)頭繭層量呈正相關(guān)，而與蟲(chóng)蛹率、幼蟲(chóng)生命率呈顯著正相關(guān)。吳小鋒等［8］認(rèn)為家蠶血液CAT活力與其發(fā)育變態(tài)、體內(nèi)代謝均有密切的關(guān)系，逆境條件下CAT活力變化幅度的大小可以作為家蠶抗逆性強(qiáng)弱的一個(gè)重要生理指標(biāo)。李群等［9］認(rèn)為柞蠶絲腺CAT活性與生命力性狀(包括收蟻結(jié)繭率)和產(chǎn)量性狀(包括結(jié)繭數(shù)和繭層量)均呈顯著正相關(guān)，而且與其雜種優(yōu)勢(shì)也呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;因此，絲腺CAT活性可作為一種生化指標(biāo)用于預(yù)測(cè)柞蠶的雜種優(yōu)勢(shì)。本研究檢測(cè)了親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力，不同繭色蠶品種、不同性別的幼蟲(chóng)血、蛹血的CAT、SOD的活力變化，試驗(yàn)結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蠶品種:原種是新九、黃白限(營(yíng)白色繭的是雄、營(yíng)黃色繭是雌)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)，一代雜交種是新九×黃白限、黃白限×新九;所有品種均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蠶絲科學(xué)系蠶種室保存提供。

主要試劑:K2HPO4、KH2PO4、NaCl、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白為北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品;SOD試劑盒、CAT試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力的測(cè)定

蠶卵蛋白的提取:分別取新九、黃白限、新九×黃白限、黃白限×新九的蠶卵0.15 g，置于研缽中，加入1.5 mL磷酸抽提緩沖液，冰浴研磨15 min，超聲波處理3 min，4 ℃、10 000 r/min，離心 20 min，沉淀保存。上清液再經(jīng)4℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液作為蠶卵可溶性總蛋白質(zhì)的樣品，分裝，于－40℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后用Bradford法［10］測(cè)定各樣品的蛋白含量，再分別按照CAT、SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蠶卵SOD、CAT的活力。

1.2.2 不同繭色蠶品種的幼蟲(chóng)血、蛹血的CAT、SOD活力的測(cè)定 幼蟲(chóng)血的收集:于5齡第4天分別對(duì)黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的幼蟲(chóng)各隨機(jī)抽取5頭蠶，剪去幼蟲(chóng)的腹足采血(加入少許苯基硫脲)，將幼蟲(chóng)的血液在4℃，15 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液置于－40℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

蛹血的收集:在蠶化蛹后的第5天，分別將黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的蠶蛹置于冰浴條件下剪破蛹的翅部，將蠶蛹的血液滴入預(yù)加微量苯基硫脲的1.5 mL離心管中，于－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

幼蟲(chóng)血、蛹血的SOD、CAT活力的測(cè)定:分別按照CAT、SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)提取的黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的幼蟲(chóng)血、蛹血CAT、SOD的活力進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 酶活力的計(jì)算公式

蠶卵CAT活力計(jì)算公式:

公式①中OD1為240 nm處零時(shí)吸光度，OD2為240 nm處1 min時(shí)吸光度，2.303為從自然對(duì)數(shù)換算成常用對(duì)數(shù)時(shí)的常數(shù)。CAT的酶活力單位定義:每克組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的CAT相對(duì)量為1個(gè)CAT活力單位(U)。

蠶卵SOD活力計(jì)算公式:

公式②中SOD的酶活力單位定義:每毫克組織蛋白中抑制率表達(dá)50%時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD量記為1個(gè)SOD活力單位(U)。

蠶血、蛹血CAT的計(jì)算公式:

公式③中的271為斜率的倒數(shù)。H2O2的酶活力單位定義:每毫升樣本將每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為1個(gè)活力單位(U)。

蠶血、蛹血總SOD活力計(jì)算公式:

酶活力單位定義:每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和F1代蠶卵蛋白的CAT活力

用磷酸緩沖液提取蠶卵蛋白，測(cè)定親本和F1代的CAT活力，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，家蠶親本新九、黃白限的CAT活力值分別是41.76、13.34 U/g。其中新九蠶卵蛋白的CAT活力值最高，與F1代新九×黃白限、黃白限×新九蠶卵蛋白的CAT活力值差異大。F1代新九×黃白限的CAT活力值最低(11.13 U/g)，低于雙親的CAT活力值。F1代黃白限×新九的CAT活力值為26.89 U/g，在雙親值之間。

圖1 親本和F1代蠶卵蛋白的CAT活力

2.2 親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力

測(cè)定家蠶親本、F1代蠶卵蛋白的SOD活力，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，家蠶親本新九、黃白限蠶卵蛋白的SOD活力值分別為15.54 U/g和14.57 U/g。F1代正交新九×黃白限蠶卵蛋白的SOD活力值為15.26 U/g，F(xiàn)1代反交黃白限×新九蠶卵蛋白的SOD活力值為14.61 U/g，由此看來(lái)F1代蠶卵蛋白的SOD活力值是在雙親之間，即，新九＞新九×黃白限 ＞黃白限×新九＞黃白限，但親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力值差異不大。

圖2 親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力

2.3 不同繭色蠶品種幼蟲(chóng)血、蛹血的CAT活力

測(cè)定家蠶不同繭色蠶品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血的CAT活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，不同繭色蠶品種黃白限(雌，黃色繭)、黃白限(雄，白色繭)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)的5齡第5天幼蟲(chóng)血的 CAT活力值分別為52.21、78.50、42.50、25.5 U/μL，第5 天蛹血的 CAT活力值分別為 77.75、104.97、60.60、54.50 U/μL。檢測(cè)結(jié)果表明，不同繭色蠶品種間的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血的CAT活力值相差較大;同一品種的5齡第5天蠶血和第5天蛹血的CAT活力也相差較大，第5天蛹血的CAT活力值明顯高于5齡第5天幼蟲(chóng)血的CAT活力值;同一品種黃白限的雌雄間也有較大差異。

圖3 不同繭色蠶品種幼蟲(chóng)血、蛹血的CAT活力

2.4 不同繭色蠶品種幼蟲(chóng)血、蛹血的SOD活力

測(cè)定家蠶不同繭色品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血的SOD活力，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，SOD活力在不同繭色蠶品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血中為黃白限(黃色繭)18.39 U/mL、黃白限(白色繭)29.15 U/mL、大造(綠色繭)20.01 U/mL、沔赤(紅色繭)22.29 U/mL;SOD活力在不同繭色蠶品種第5天蛹血中為黃白限(黃色繭)21.02 U/mL、黃白限(白色繭)20.01 U/mL、大造(綠色繭)20.44 U/mL、沔赤(紅色繭)20.72 U/mL。從圖4還可以看出，SOD活力在不同繭色蠶品種間有差異，在雌雄間(黃白限品種)也有差異;同一品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血與第5天蛹血的SOD活力雖有差異，但差別不大。

圖4 不同蠶品種的蠶血、蛹血的SOD活力

3 小結(jié)與討論

3.1 親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力

本實(shí)驗(yàn)對(duì)親本(新九、黃白限)和F1代(新九×黃白限、黃白限×新九)蠶卵的SOD、CAT活力檢測(cè)與分析結(jié)果表明，一代雜交種蠶卵的SOD活力是在雙親之間，這與劉春等［4］的研究結(jié)果相一致。對(duì)蠶卵的CAT活力測(cè)定分析表明，一代雜交種的蠶卵CAT活力與親本的蠶卵蛋白CAT活力有很大的差異，一代雜交種正交蠶卵的CAT活力低于雙親，而反交蠶卵的CAT活力在雙親之間。

3.2 不同繭色蠶品種幼蟲(chóng)血、蛹血的SOD和CAT活力

對(duì)不同繭色蠶品種［黃白限(雌，黃色繭)、黃白限(雄，白色繭)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)］的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血進(jìn)行SOD活力檢測(cè)的結(jié)果表明，在本測(cè)試的蠶品種中，不同繭色的蠶品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血的SOD活力幾乎差異不大，雌蛹血的SOD活力與雄蛹血的SOD活力差異也不大;同一品種的5齡第5天幼蟲(chóng)血與第5天蛹血的SOD活力雖有差異但差別不大。不同繭色蠶品種間的5齡第5天幼蟲(chóng)血和第5天蛹血的CAT活力值相差較大，第5天蛹血的CAT活力值明顯高于5齡第5天幼蟲(chóng)血的CAT活力值，同一品種黃白限的雌雄間也有較大差別。

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