龔競，尚杉，張育浩，顏嘉敏，朱勇

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400715)

家蠶Bombyxmori是一種經(jīng)濟(jì)昆蟲，在我國有著5 000年的飼養(yǎng)歷史，在生理學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)上取得了豐碩的研究成果。家蠶是典型的卵滯育昆蟲，不同品種蠶卵滯育的程度有所不同：北方地區(qū)蠶卵多為滯育品種，每年只孵化1次(一化性)或2次(二化性)；南方地區(qū)氣候溫暖潮濕，很多品種1年可孵化多次(多化性)[1]。其中，二化性品種可以通過調(diào)控母代的催青(解除滯育后的蠶卵在適當(dāng)溫度等條件下誘導(dǎo)孵化的過程)飼養(yǎng)條件，如溫度、光照、濕度等來控制子代蠶卵的滯育性[2]。同時，人們在滯育卵產(chǎn)下后的適當(dāng)時期，通過一些物理、化學(xué)方法阻止蠶卵進(jìn)入滯育，如酸類浸漬、溫水浸漬、有機(jī)溶劑處理、摩擦、高濃度氧(O2)處理(簡稱高氧法)等[3-7]，使蠶卵進(jìn)入活化狀態(tài)，按照人們生產(chǎn)生活的需要生長發(fā)育。在蠶業(yè)生產(chǎn)上，傳統(tǒng)采用HCl 處理法(簡稱HCl法)阻斷或者解除滯育。該方法對處理條件要求嚴(yán)格，導(dǎo)致蠶卵死亡的情況時有發(fā)生，并且HCl 的大量使用對環(huán)境會造成一定的危害，找到更安全、環(huán)保、便捷的阻斷滯育方法是保證蠶業(yè)生產(chǎn)順利發(fā)展的重要內(nèi)容。

隨著轉(zhuǎn)座子在家蠶轉(zhuǎn)基因中的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶基因功能研究、遺傳素材創(chuàng)新和生物反應(yīng)器開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[8-12]。由于轉(zhuǎn)基因家蠶制備需要經(jīng)過篩選、驗證、雜交等多個步驟，還需要經(jīng)過多代飼養(yǎng)獲得純品系，目前多化性品種的蠶卵仍然是轉(zhuǎn)基因家蠶研究的首選材料。可是，多化性材料必須進(jìn)行連續(xù)飼養(yǎng)，不僅增加了生產(chǎn)成本和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)丟失的風(fēng)險，而且多化性材料的經(jīng)濟(jì)性狀跟實用的二化性品種比較起來還有一定差距，在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中受到一定的影響。有研究者曾通過早浸酸(即傳統(tǒng)的HCl法)、低溫催青[13-14]等方法處理二化性品種的蠶卵，試圖獲得轉(zhuǎn)基因家蠶的非滯育卵，但是存在早浸酸時間范圍與顯微注射時間沖突及低溫催青時間過長等問題，使得這些方法在科研和生產(chǎn)應(yīng)用上受到了限制。因此，有必要探尋更為高效的控制蠶卵滯育性的技術(shù)和方法，滿足蠶桑生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因研究對不同化性品種的需求。

本研究，采用高氧法對不同化性品種蠶卵和轉(zhuǎn)基因蠶卵材料進(jìn)行阻斷滯育，調(diào)查處理后二化性蠶卵阻斷滯育的效果，對最佳處理條件進(jìn)行篩選；以高氧法優(yōu)選的處理條件，對照生產(chǎn)上傳統(tǒng)的HCl 法處理，比較二者阻斷滯育的效果。進(jìn)而將該方法應(yīng)用于一化性品種和顯微注射的轉(zhuǎn)基因蠶卵阻斷滯育，期望為生產(chǎn)上替代傳統(tǒng)阻斷滯育的HCl 法和在家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)中加快轉(zhuǎn)基因材料選育進(jìn)度提供安全環(huán)保的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用試驗材料為二化性家蠶品種‘大造’，由西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供，母代材料在25℃條件下催青，戊3胚子前自然光照，戊3胚子后每天18 h 長光照。蛹期25℃、相對濕度(RH)75%和自然光照保護(hù)，羽化后同一飼育區(qū)交配制種，產(chǎn)下滯育卵。另一試驗材料為一化性家蠶品種‘土耳其’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。常規(guī)催青、常規(guī)飼養(yǎng)，蛹期25℃、RH75%和自然光照保護(hù)，羽化后同一飼育區(qū)交配制種，產(chǎn)下滯育卵。

1.2 載體材料

pBac［3xp3EGFP］載體[15]由家蠶基因組國家重點實驗室提供。

1.3 主要試劑及儀器

純氧(重慶強(qiáng)勝氣體有限公司)，HC l(重慶科試)，三氣培養(yǎng)箱(HF100，力康)，人工氣候箱(PGX-300C，寧波東南)，掃描電鏡(JCM 500，NIKON)，顯微注射儀(Eppendorf,德國)。

1.4 主要溶液及配制

HCl溶液：將HCl原液緩慢倒入純水中，攪拌均勻，待溫度降至室溫后用比重計測量其相對密度為1.100。

PBS緩沖液：Na2HPO40.72 g，KH2PO40.12 g，NaCl4 g，KCl 0.1 g，ddH2O 400mL，pH 調(diào)至7.4，定容至500mL。

1.5 主要試驗方法及步驟

1.5.1 蠶卵的處理1)高氧法：參考Sonobe 等[5]的研究，產(chǎn)卵后20 h 的蠶卵，用體積分?jǐn)?shù)(φ)為30%、40%、50%、60%、70%和80%的O2分別處理40 h，每處理重復(fù)28個蛾圈；產(chǎn)卵后4、12、20、32和48 h的蠶卵，用φ為70%的O2分別處理10、20、30、40、50、60和72 h，每處理重復(fù)3個蛾圈，從而篩選最佳條件。

2) HCl 法：滯育卵產(chǎn)后20 h 用HCl 進(jìn)行處理［室溫25℃，相對密度(比重)為1.100的HCl 溶液浸酸70 min］，用流水洗凈，晾干，各處理均重復(fù)3 個蛾圈。

高氧法和HCl 法的‘大造’蠶卵孵化率、孵化時間比較中，調(diào)查3個蛾圈。高氧法應(yīng)用于‘土耳其’蠶卵時，重復(fù)15個蛾圈。為了保證材料的準(zhǔn)確性，在所有處理取材的過程中，同一蛾圈取一半蠶卵，觀察其滯育性。

1.5.2 蠶卵電鏡掃描高氧法和HCl法處理的‘大造’蠶卵和未處理的滯育卵，在產(chǎn)后的20、48和72 h 及5和9 d 分別取樣，每次取20粒蠶卵，先用1×PBS進(jìn)行清洗，洗去卵殼表面附著物。采用戊二醛和鋨酸雙固定：取洗凈的蠶卵置于φ為2.5%戊二醛中，4℃條件下固定2 h，然后用1×PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10m in；接著用φ為1%的鋨酸固定2 h，用0.1mol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10m in。經(jīng)過雙固定的樣品，用乙醇和叔丁醇進(jìn)行梯度脫水，樣品在空氣中自然干燥。干燥好的樣品用導(dǎo)電膠粘貼在掃描電鏡的載物臺上，離子濺射儀鍍膜后用掃描電鏡對蠶卵表面進(jìn)行觀察。

1.5.3 蠶卵顯微注射 1)以‘大造’品種作為材料，獲取滯育蠶卵：將蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙，在黑暗或者弱光的環(huán)境中產(chǎn)卵，每間隔1 h收集1次蠶卵，獲得G0代蠶卵并將其置于室溫的環(huán)境中保護(hù)；

2)將蠶卵用鑷子轉(zhuǎn)移至用φ為75%的乙醇溶液消毒的載玻片上，排列整齊，取剛搜集的蠶卵用顯微注射儀將1～15 nL、總質(zhì)量濃度400 ng/μL 的piggyBac空載：pBac［3xp3EGFP］轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，顯微注射在產(chǎn)后2～4 h 內(nèi)完成，得到轉(zhuǎn)基因滯育蠶卵；

3)將注射蠶卵在產(chǎn)后20 h 經(jīng)φ為35%的甲醛蒸汽消毒5m in，置于三氣培養(yǎng)箱，在25℃、RH為75%、密閉條件下，充入φ為70%的氧氣，保持充氧40 h，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因滯育蠶卵經(jīng)充氧處理后的轉(zhuǎn)青及孵化情況，并以未處理的滯育卵為對照。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPad Prism 5.0軟件(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗比較不同處理組的統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2阻斷滯育最佳條件的篩選

2.1.1 O2阻斷滯育最佳濃度的篩選 選擇產(chǎn)后20 h的蠶卵處理40 h，對O2的濃度進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果表明，φ(O2)為40%、50%、60%、70%和80%時，孵化率在70%以上，φ(O2)為60%、70%和80%時，孵化率在85%以上，其中φ(O2)為70%的處理組出現(xiàn)97.88%的最高孵化率(圖1)。

圖1 不同濃度O2阻斷滯育后的二化性‘大造’蠶卵孵化率Fig.1 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs under O 2 treatment with different concentrations

2.1.2 O2阻斷滯育最佳時間的篩選 在獲得O2最佳處理濃度(φ為70%)后，對蠶卵產(chǎn)后取樣時間和高氧處理時間進(jìn)一步調(diào)查。結(jié)果表明，產(chǎn)后4、12和20 h 取樣的蠶卵，在30、40和50 h 處理時間段里都能取得75%以上的孵化率，其中，產(chǎn)后20 h 取樣的蠶卵在O2處理40 h 后孵化率達(dá)到98.67%；數(shù)據(jù)十分接近的還有產(chǎn)后12 h 取樣的蠶卵，在O2處理50 h 后孵化率達(dá)到98.33%，處理時間在30～40 h時孵化率為86.71%～91.13%；產(chǎn)后4 h 取樣的蠶卵在O2處理40 h 后的孵化率達(dá)到最高值(86.12%)；而產(chǎn)后32 h 取樣蠶卵的最高孵化率為30.98%，出現(xiàn)在O2處理后40 h；產(chǎn)后48 h 取樣的蠶卵，無論處理10 h，還是72 h 蠶卵都不孵化(圖2)。

根據(jù)以上試驗，篩選出O2阻斷滯育(高氧法)的最佳條件為：產(chǎn)后20 h 的蠶卵在φ(O2)為70%條件下處理40 h。

2.2 高氧法和HCl 法的蠶卵孵化率比較

采用φ為70%的O2(高氧法)和HCl 法處理滯育卵，以產(chǎn)后無處理的滯育卵為對照(CK)，比較2種方法阻斷滯育的效果。2種方法處理后10 d 蠶卵的孵化率調(diào)查結(jié)果見表1。高氧法和HCl法都能較好地阻斷蠶卵滯育。同等條件下，高氧法的效果更好，孵化率為(97±1)%；HCl 法的孵化率為(93±1)%。

圖2 不同產(chǎn)后取卵時間及高氧處理時間的二化性‘大造’蠶卵的孵化率Fig.2 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs treated after different oviposition time and hyperoxia treating time

2.3 高氧法和HCl 法的蠶卵孵化時間比較

對高氧法和HCl法的蠶卵孵化時間進(jìn)行了比較(圖3)，以產(chǎn)后無處理的滯育卵為對照(CK)。結(jié)果表明，高氧法處理的蠶卵在產(chǎn)卵230 h 開始孵化；到了248 h 孵化率就已經(jīng)達(dá)到了21.9%，但此時的HCl法處理的蠶卵基本才開始有孵化的跡象，2種處理方法的孵化率差異顯著；此后，從產(chǎn)后248 h到260 h，2種方法的的蠶卵孵化率都明顯上升；一直到278 h，高氧法的蠶卵孵化率始終高于HCl 法的蠶卵孵化率。從以上結(jié)果可以看出，高氧法的蠶卵孵化開始時間比HCl法的蠶卵早18 h，表明蠶卵在高氧法的處理條件下發(fā)育進(jìn)程快于HCl 法處理的蠶卵。

表1 高氧法和HCl 法處理后10 d 二化性‘大造’蠶卵的孵化率1)Table 1 The hatching rates of bivoltine silkworm ‘Dazao’eggs treated by hyperoxia and HCl after 10 days

圖3 二化性‘大造’蠶卵在不同處理條件下的孵化率Fig.3 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs under different treatment

2.4 高氧法處理對蠶卵表面刻蝕效果和蠶卵表面氣孔的影響

滯育卵分別用高氧法最佳條件和HCl 法處理，分別在產(chǎn)后20、48和72 h 及5和9 d 取樣,以產(chǎn)后相同時段的無處理滯育卵為對照進(jìn)行卵殼表面掃描電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高氧法和HCl 法剛處理的蠶卵卵殼表面幾乎無變化；48 h 時觀察到蠶卵卵殼表面有較多“脂質(zhì)”脫落；72 h 時仍然能觀察到“脂質(zhì)”脫落(圖4)，此后時間點“脂質(zhì)”脫落迅速減少。而對照中沒有觀察到此現(xiàn)象。

高氧法和HCl 法處理后與對照組比較卵殼表面氣孔大小，最初時差異不大，在48 h 時處理組氣孔開始增大，72 h～9 d(孵化前)期間處理組氣孔進(jìn)一步增大，而對照組氣孔隨時間逐漸縮小，到9 d 時與處理組形成鮮明對比(圖5)。

2.5 高氧法在一化性家蠶品種上的應(yīng)用

圖4 高氧及HCl 法處理后不同發(fā)育時間的二化性‘大造’卵殼表面掃描電鏡觀察Fig.4 Scanning electron microscopy observation of eggshell surface of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs of different developmental time after hyperoxia and HCl treatments

圖5 高氧及HCl 法處理后不同發(fā)育時間的二化性‘大造’卵殼表面氣孔掃描電鏡觀察Fig.5 Scanning electronmicroscopy observation of aeropyle surface of bivoltine silkworm‘Dazao’eggsof different development timeafter hyperoxia and HCl treatments

為了了解高氧法阻斷滯育在其他品種的效果，用該方法處理一化性品種‘土耳其’，觀察其孵化效果。結(jié)果表明，一化性的品種同樣可以通過高氧法有效阻斷滯育，平均孵化率為(71±20)%(表2)，但是數(shù)據(jù)方差較大，最高孵化率可以達(dá)到98.82%，而最小孵化率則為42.59%，對照全部為滯育卵。

2.6 高氧法在家蠶轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用

將高氧處理蠶卵阻斷滯育的方法應(yīng)用到家蠶轉(zhuǎn)基因上。經(jīng)轉(zhuǎn)基因顯微注射處理后，以產(chǎn)后20 h的注射滯育蠶卵為試驗對象，在φ(O2)為70%的條件下充氧處理40 h，處理后的蠶卵常規(guī)催青，約在10 d 后開始孵化，孵化時間為5 d。結(jié)果(表3)表明，高氧法處理能有效地阻斷轉(zhuǎn)基因注射蠶卵滯育，轉(zhuǎn)青率為(61±14)%，孵化率為(49±9)%，而對照孵化率為0。

表2 高氧法處理一化性‘土耳其’阻斷滯育效果分析Table 2 Analyses of prevention effects of diapause in univoltine silkworm‘Tuerqi’eggsby hyperoxia method

表3 高氧法處理轉(zhuǎn)基因二化性‘大造’蠶卵阻斷滯育效果分析Table 3 Analysesof prevention effectsof diapause in transgenic bivoltine silkworm‘Dazao’eggsby hyperoxia method

3 討論與結(jié)論

滯育是生物體度過困難環(huán)境而進(jìn)化來的一種生存策略。家蠶是典型的卵滯育昆蟲。在生產(chǎn)上，最常用的家蠶卵阻斷滯育的方法是HCl 法，有一半以上的蠶種通過此方法打破滯育[16]。該方法在1877年就有過報道，1916年荒本等人逐漸將該方法轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)工藝應(yīng)用于蠶業(yè)生產(chǎn)[17]，為人類蠶絲業(yè)的發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。關(guān)于高氧法阻斷滯育最早的報道幾乎與HCl 法在同一個時代[17]，20世紀(jì)70—80年代少數(shù)日韓研究者圍繞卵殼通透性、蠶卵呼吸率等問題展開了研究[5，18]，此后便鮮有相關(guān)研究報道。高氧法之前未能應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，可能是當(dāng)時的試驗條件未能達(dá)到生產(chǎn)上的要求或各種儀器試劑的限制，不利于在生產(chǎn)上廣泛推廣使用，或者生產(chǎn)成本偏高。但是，在科技高度發(fā)達(dá)的今天，環(huán)境友好成為了經(jīng)濟(jì)發(fā)展的前提條件，蠶種場大量使用HCl將逐漸受到限制，因此轉(zhuǎn)而使用更為環(huán)保、綠色的方法勢在必行。高氧法作為阻斷滯育的方法，取樣時間和處理時間都比較寬泛，使用密閉的培養(yǎng)箱或容器就可以實現(xiàn)，操作較簡單、安全，技術(shù)人員也容易掌握。

家蠶滯育機(jī)理的研究具有科學(xué)和產(chǎn)業(yè)上的雙重重要性，因此受到人們普遍關(guān)注。但是，由于影響因素眾多且是獨特的跨帶傳遞方式，比較復(fù)雜，滯育機(jī)理和阻斷滯育機(jī)理至今仍不十分清楚。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)高氧法和HCl 法處理后獲得的差異基因均在氧化還原功能上富集，并且表達(dá)模式趨同，推測其阻斷滯育的機(jī)制相似[19]。在隨后的掃描電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)HCl法處理后的蠶卵表面有“脂質(zhì)”脫落物出現(xiàn)，蠶卵氣孔隨著發(fā)育逐漸增大[20]，本文中高氧法處理的蠶卵也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，推測這是蠶卵胚胎從滯育轉(zhuǎn)而發(fā)育的表現(xiàn)之一。

在家蠶轉(zhuǎn)基因研究使用的品種中，二化性家蠶品種經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)異，不存在保種困難的問題，且已經(jīng)大量用于蠶業(yè)生產(chǎn)，如果使用二化性品種作為家蠶轉(zhuǎn)基因的受體材料，在轉(zhuǎn)基因蠶的推廣上將極具優(yōu)勢。然而，二化性家蠶品種用于轉(zhuǎn)基因研究和應(yīng)用，最重要且最需要解決的問題就是阻斷滯育，使之能夠連續(xù)飼養(yǎng)。目前，低溫催青法耗時長，需要超過1個月的時間，且還需要反季節(jié)飼養(yǎng)[21-22]，這些問題無疑都增加了制備轉(zhuǎn)基因家蠶的難度；而早浸酸法由于浸酸時間過早、脫酸不凈等原因影響轉(zhuǎn)基因注射后蠶卵的轉(zhuǎn)青率和孵化率，并且最佳注射時間與浸酸時間沖突[13-14]，達(dá)不到實際科研生產(chǎn)要求。高氧法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因二化性家蠶蠶卵阻斷滯育，處理注射后的轉(zhuǎn)基因蠶卵，其平均孵化率為(49±9)%，遠(yuǎn)高于非滯育的多化性蠶品種的孵化水平，與低溫催青處理的蠶卵孵化率持平[15]，但是高氧法突出優(yōu)點是用時短，飼育簡單。高氧法在轉(zhuǎn)基因家蠶蠶卵制備上的應(yīng)用為阻斷轉(zhuǎn)基因家蠶卵滯育提供了一種高效簡便的方法，有利于轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊的家蠶品種。

綜上所述，本文中高氧法不僅能較好地對二化性蠶品種阻斷滯育，而且將該處理條件應(yīng)用于一化性蠶品種，也取得了不錯的孵化效果，說明高氧法阻斷滯育是可行的，不局限于某種蠶品種。另外，高氧法是在常溫常壓下進(jìn)行的，與傳統(tǒng)HCl 法相比操作簡單，易于掌握，孵化時間短，適合向普通蠶農(nóng)推廣。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中，該方法更能發(fā)揮其特有優(yōu)勢，顯著縮短轉(zhuǎn)基因家蠶培育時間，突破了轉(zhuǎn)基因家蠶的技術(shù)障礙，為家蠶轉(zhuǎn)基因研究注入新活力。當(dāng)然，在生產(chǎn)上推廣該方法還需要更多品種、更大范圍的進(jìn)一步調(diào)查，開發(fā)適合于生產(chǎn)上使用的相關(guān)設(shè)備或者工藝條件是我們下一步需要研究的內(nèi)容。