林素坤，劉凱鴻，王瑞飛，劉本菊，張悅，吳吉英子，程東美，徐漢虹，張志祥

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510642；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東廣州510225)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperdaJ.E.Sm ith起源于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是典型的遷飛性害蟲[1]，其幼蟲可取食玉米、水稻、高粱和甘蔗等350多種植物[2-3]。草地貪夜蛾于2019年1月入侵我國云南[4-7]，截至2019年7月23日，已經(jīng)蔓延到我國21個省(市、自治區(qū))，嚴重威脅我國農(nóng)業(yè)及作物生產(chǎn)[8]。自草地貪夜蛾侵入我國以來，傳播迅速，且我國大部分地區(qū)均適宜草地貪夜蛾生存，如果不進行人為干預(yù)，其勢必會對我國作物安全造成重大影響[9]。化學(xué)農(nóng)藥對草地貪夜蛾的防治已有幾十年的應(yīng)用歷史[10]，目前許多國家的田間種群對多數(shù)傳統(tǒng)農(nóng)藥已產(chǎn)生了不同程度的抗性[11]，靶標害蟲產(chǎn)生抗性使得農(nóng)藥的使用劑量加大，而農(nóng)藥使用劑量的增加會引發(fā)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、環(huán)境安全和生物多樣性問題[12-14]。近年來，世界各國都在大力推廣和使用生物農(nóng)藥來防治害蟲，生物農(nóng)藥防治效果獨特，具有多重作用機制，不易引起抗藥性，而且對環(huán)境安全[15]。印楝素是一種從印楝中提取出來的生物活性物質(zhì)，是世界公認的廣譜、高效、低毒、易降解、無殘留的殺蟲劑[16-17]。許多研究表明，印楝素對多種害蟲具有拒食、觸殺、胃毒、抑制生長發(fā)育和影響卵巢發(fā)育的作用[18]。本文測定了室內(nèi)0.3%(φ)印楝素乳油和40%(w)印楝素干粉對草地貪夜蛾毒殺活性和拒食活性以及0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾的田間防效，旨在為科學(xué)防治草地貪夜蛾提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源2019年5月在廣州市花都區(qū)花山鎮(zhèn)紫西村玉米地(113°26′50.43″N，23°48′66.63″E)采集草地貪夜蛾卵塊，因1齡和2齡幼蟲取食葉片后會留下一層膜，3齡及高齡幼蟲可以把葉片吃穿，1齡幼蟲取食量較小，試驗葉片可能無法滿足高齡幼蟲的取食量，故卵孵化后，以玉米嫩葉飼養(yǎng)至2齡和3齡幼蟲供試。飼養(yǎng)條件為溫度25℃±2℃、濕度為60% ± 5%、光周期為16 h 光∶8 h 暗。

1.1.2 供試玉米供試玉米種植地為廣州市花都區(qū)花山鎮(zhèn)紫西村，試驗時玉米處于喇叭口期，植株長勢均勻。試驗前及試驗過程中均未噴施其他農(nóng)藥，玉米栽培及管理條件符合當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)實踐管理。

1.1.3 供試藥劑0.3%印楝素乳油，成都綠金生物科技有限責(zé)任公司；40%印楝素干粉，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室。

1.1.4 試驗儀器及工具電動噴霧器、葉面積測定儀、定量藥匙、移液槍、培養(yǎng)皿、天平、水桶、量杯、濾紙、剪刀、毛刷等。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)毒力試驗采用浸葉法[19]測定了40%印楝素干粉對草地貪夜蛾2齡和3齡幼蟲的毒力，根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，將40%印楝素干粉用φ為70%的丙酮溶液配制成0.1、0.5、1.0和5.0mg/L的4個印楝素質(zhì)量濃度。將潔凈的新鮮玉米嫩葉剪成3 cm×5 cm 的葉片，浸漬藥液3 s，自然晾干后置于墊有濾紙(直徑9 cm)保濕的培養(yǎng)皿中，再選取大小一致的2齡幼蟲20頭饑餓處理4 h 后接入培養(yǎng)皿內(nèi)，3齡幼蟲每皿只接入1頭，每處理測定20頭，每處理重復(fù)3次。以φ為70%的丙酮溶液浸漬3 s后自然晾干的嫩葉喂食為對照。

將0.3%印楝素乳油用水稀釋成0.1、0.5、1.0和5.0mg/L 的4個印楝素質(zhì)量濃度，以清水為對照，均勻噴灑至盆栽玉米葉片上，待其晾干后，選取新鮮玉米嫩葉剪成3 cm×5 cm 的葉片，置于墊有濾紙(直徑9cm)保濕的培養(yǎng)皿中，再選取大小一致的2齡幼蟲20頭饑餓處理4 h 后接入培養(yǎng)皿內(nèi)，3齡幼蟲每皿只接入1頭，每處理測定20頭、重復(fù)3次。

處理后1、2和3 d 用葉面積測定儀測定取食面積，并根據(jù)以下公式計算拒食率：

拒食率=(對照組取食葉面積?處理組取食葉面積)/對照組取食葉面積×100%。

并使用Excel 進行毒力回歸計算，得到毒力回歸方程、AFC50、上下限及相關(guān)系數(shù)。

處理后1、2、3、5和7 d 檢查幼蟲的存活狀態(tài)，以毛刷輕觸幼蟲體表，無反應(yīng)判定為死亡，記錄死亡數(shù)，按照以下公式計算各處理幼蟲的死亡率和校正死亡率：

校正死亡率=(處理組死亡率?對照組死亡率)/(100?對照組死亡率)×100%。

使用Excel 進行毒力回歸計算，得到毒力回歸方程、LC50、上下限及相關(guān)系數(shù)，采用G raphPad Prism 5作圖，SPSS19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行差異顯著性分析。

1.2.2 田間藥效試驗田間藥效試驗于2019年6月17日至6月24日在廣東省廣州市花都區(qū)花山鎮(zhèn)紫西村玉米地進行，草地貪夜蛾為害期為幼蟲各個階段，試驗期間玉米正處于喇叭口期，試驗地玉米52 500株/hm2。試驗共設(shè)3個處理濃度，即用水將0.3%印楝素乳油稀釋5 0 0、8 0 0和1 0 0 0倍，稀釋倍數(shù)越高，藥劑濃度越低。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)小區(qū)，每個小區(qū)30 m2，各小區(qū)之間設(shè)置1 m寬的隔離帶，另設(shè)對照小區(qū)3個，各30m2。試驗用藥時天氣多云，施藥當(dāng)天及施藥后3 d 無降雨。

將0.3%印楝素乳油稀釋后，對玉米進行全株均勻噴霧施藥，制劑用藥量為750 mL/hm2。對照小區(qū)使用清水按照相同方法處理。

在每個小區(qū)中采用“Z”字型六點取樣法，每點5株，共計30株，試驗前做好標記并統(tǒng)計玉米上的蟲口數(shù)量，施藥后1、3和7 d 按照相同方式調(diào)查蟲口數(shù)量，并同時觀察小區(qū)玉米生長情況及藥害發(fā)生情況。按照以下公式計算蟲口減退率和防治效果，并用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行差異顯著性分析。

蟲口減退率= (藥前活蟲數(shù)?藥后活蟲數(shù))/ 藥前活蟲數(shù)×100%，

防治效果= (處理區(qū)蟲口減退率?對照組蟲口減退率)/(1?對照組蟲口減退率)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對草地貪夜蛾幼蟲的室內(nèi)毒殺活性

為評價使用印楝素對草地貪夜蛾的毒殺活性與防效，在室內(nèi)測定了0.3%印楝素乳油和40%印楝素干粉對草地貪夜蛾幼蟲的毒殺活性，結(jié)果見圖1和表1。從圖1可以看出，質(zhì)量濃度為5mg/L 的印楝素對草地貪夜蛾2齡和3齡幼蟲具有良好的毒殺活性。在質(zhì)量濃度為5mg/L時，0.3%印楝素乳油處理草地貪夜蛾后1、2、3、5和7 d，2齡幼蟲的死亡率分別為6.67%、23.33%、53.33%、70.00%和86.67%，3齡幼蟲的死亡率分別為8.33%、26.67%、60.00%、80.00%和90.00%；40%印楝素干粉處理草地貪夜蛾后1、2、3、5和7 d，2齡幼蟲的死亡率分別為1.67%、16.67%、50.00%、61.67%和75.00%，3齡幼蟲的死亡率分別為6.67%、20.00%、53.33%、65.00%和83.33%。經(jīng)Tukey 法差異顯著性分析，在P＜0.05水平上，7 d 后處理組與對照組的死亡率差異顯著，處理組之間無顯著差異，對照組之間無顯著差異。試驗發(fā)現(xiàn)，印楝素對草地貪夜蛾的毒殺效果較為緩慢，未死亡的幼蟲出現(xiàn)行動遲緩、軀體僵硬等現(xiàn)象。

圖1 印楝素(ρ=5m g/L)對草地貪夜蛾2齡和3齡幼蟲的室內(nèi)毒殺活性Fig.1 Indoor toxicity activity of azadirachtin(ρ=5m g/L)on the 2nd and 3 rd instar larvae of Spodoptera frugiperda

從表1 可以看出，相較于40%印楝素干粉，0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾有更好的毒力，處理后7 d 2齡和3齡幼蟲的LC50值為0.59和0.46mg/L，而40%印楝素干粉處理草地貪夜蛾后7 d，2齡和3齡幼蟲的LC50值為0.93和0.79mg/L。試驗中，印楝素對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒殺活性要高于2齡幼蟲。

2.2 印楝素對草地貪夜蛾幼蟲的室內(nèi)拒食活性

本文為評價使用印楝素對草地貪夜蛾的拒食活性與防效，在室內(nèi)測定了0.3%印楝素乳油和40%印楝素干粉對草地貪夜蛾幼蟲的拒食活性，結(jié)果見表2。從表2可以看出，印楝素對草地貪夜蛾3 齡幼蟲的拒食效果要較好于2齡幼蟲；相較于40%印楝素干粉，0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾具有更好的拒食活性，處理后3 d，2齡和3齡幼蟲的AFC50值分別為0.30和0.12mg/L；而40%印楝素干粉處理草地貪夜蛾后3 d，2齡和3齡幼蟲的AFC50值分別為0.53和0.30mg/L。試驗觀察發(fā)現(xiàn)，處理組的幼蟲出現(xiàn)逃避葉片、顯著減少取食的現(xiàn)象。

表1 印楝素對草地貪夜蛾2齡和3齡幼蟲的毒力分析Table 1 The toxicity analysesof azadirachtin on the 2nd and 3 rd instar larvae of Spodoptera frugiperda

表2 印楝素對草地貪夜蛾2齡和3齡幼蟲的拒食活性Table 2 Theanti-feedant activitiesof azadirachtin on the2nd and 3 rd instar larvaeof Spodoptera frugiperda

2.3 印楝素對草地貪夜蛾的田間防效

田間測定了0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾的防治效果，并與10%(φ)氯氰菊酯乳油1 000倍液進行比較，結(jié)果見表3。施藥后觀察，0.3%印楝素乳油對玉米安全，玉米正常生長，無藥害產(chǎn)生，對非靶標生物也未見明顯的不良影響。從表3可以看出，在印楝素藥劑稀釋500倍時，施藥后7 d，0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾具有良好的防效，可以將蟲口密度控制在較低的水平。稀釋500 倍時，施藥后1、3 和7 d防效分別達到24.83%、50.34%和75.50%，稀釋800倍時，施藥后1、3和7 d 的防效分別為19.76%、41.51%和66.03%，稀釋1 000倍時，施藥后1、3 和7 d的防效分別為10.90%、32.70%和53.37%。試驗發(fā)現(xiàn)，0.3%印楝素乳油3個處理濃度之間，稀釋倍數(shù)越低，即濃度越高，對草地貪夜蛾的防效越佳。施藥后草地貪夜蛾對小區(qū)玉米再取食率低，葉片的完整程度較為理想；草地貪夜蛾的卵塊明顯減少，但0.3%印楝素乳油防治草地貪夜蛾的速效性不佳。

表3 0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾的田間防效1)Table 3 The field control effect of 0.3% azadirachtin EC for Spodoptera frugiperda

3 討論與結(jié)論

本文通過測定印楝素對草地貪夜蛾的毒殺活性、拒食活性以及防治效果，評價了印楝素在草地貪夜蛾防治工作中的應(yīng)用潛力。試驗中發(fā)現(xiàn)，相較于40%印楝素干粉，0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾具有更好的毒力。在生產(chǎn)過程中，40%印楝素干粉經(jīng)除雜凈化，會去除一些活性物質(zhì)，而0.3%印楝素乳油中的活性物質(zhì)較多，這些活性物質(zhì)與印楝素發(fā)生一定的協(xié)同作用，從而造成0.3%印楝素乳油對草地貪夜蛾的毒力作用優(yōu)于40%印楝素干粉。對比2齡幼蟲和3齡幼蟲，發(fā)現(xiàn)印楝素對3齡幼蟲具有更好的毒殺活性和拒食活性。一般情況下，鱗翅目1～2齡害蟲是對農(nóng)藥抵抗力最弱的階段，殺蟲劑對鱗翅目2齡害蟲的毒力作用要強于3齡幼蟲[20]。本研究對草地貪夜蛾取食行為的觀察發(fā)現(xiàn)，2齡幼蟲由于吃不穿葉片，取食后葉片還留下一層膜，取食同等的葉面積，2齡幼蟲取食的藥量接近3齡幼蟲取食藥量的一半，因而造成印楝素對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力作用強于2齡幼蟲。

抗藥性是殺蟲劑使用留給害蟲的遺傳特征[21]，草地貪夜蛾作為一種遷飛性害蟲，無疑會將抗性基因擴散，從而放大抗藥性的問題，抗藥性問題會增加農(nóng)藥的使用劑量，進而引發(fā)農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全和環(huán)境安全等問題。生物農(nóng)藥對環(huán)境安全，并且由于具有多重作用機制不易引起抗藥性，目前已成為防治害蟲的重要手段之一[22]，雖然試驗中印楝素對草地貪夜蛾的防治時效性不佳，但印楝素作為植物殺蟲劑的代表，幾乎達到了理想農(nóng)藥所要求的全部標準，不僅無明顯的脊椎動物毒性或植物藥害，還能在環(huán)境中迅速降解[23]。試驗中發(fā)現(xiàn)，印楝素不僅對草地貪夜蛾具有良好的毒殺活性，還具有明顯的拒食活性，在田間施藥后，草地貪夜蛾對玉米取食率明顯降低，葉片較為完整，在印楝素毒殺和拒食雙重作用機制下，草地貪夜蛾的危害得到了有效控制。綜上所述，在草地貪夜蛾的防治工作中，印楝素具有廣闊的應(yīng)用前景。