孫麗萍 彭定利 譯

1 引言

牧豆樹是干旱地帶的一種十分重要的植物，它不但能在干旱季節(jié)表現(xiàn)出超強固氮能力，而且還是許多動物的庇護所和食物來源，這些動物以牧豆樹的花蜜、花粉、樹葉以及水果為食。牧豆樹是四、五月份墨西哥杜蘭戈州干旱、半干旱地帶蜜蜂的唯一花蜜和花粉來源。當?shù)胤滢r(nóng)在這一時期收獲的蜂蜜風味一致，均為牧豆樹蜂蜜，同樣這兩個月蜜蜂采集的花粉為純牧豆樹花粉。

牧豆樹是具有生物學(xué)特性的天然產(chǎn)品的一個重要來源。對牧豆樹花粉乙醇提取物體外抗氧化力的評價表明，該花粉具有較強的自由基清除能力，自由基清除力與其酚類物質(zhì)的組成有關(guān)?；ǚ壑械姆宇惢衔镏饕S酮苷和羥基肉桂酸，不同種類花粉的酚類化合物的組成有所不同，并與花粉的藥理特性（抑菌、抗腫瘤、止瀉、抗氧化）有一定的關(guān)系。

眾所周知，化學(xué)抗氧化性或體外生物抗氧化性的評價并不能代表真正的體內(nèi)活動。本文的目的在于通過體外實驗和體內(nèi)實驗研究牧豆樹蜂花粉酚類物質(zhì)組成與其抗氧化能力的關(guān)系，即在體外體系中將牧豆樹蜂花粉酚類提取物作為小鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制劑；在體內(nèi)體系（即溴苯誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型肝勻漿）運用硫代巴比妥酸法（TBARS）對抗氧化能力進行定量分析。同時對體內(nèi)和體外兩種系統(tǒng)下得到的結(jié)果進行比較。

2 材料與方法

2.1 花粉樣品

實驗所用的三種牧豆樹蜂花粉由當?shù)仞B(yǎng)蜂人專供。這些樣品可作為2002年4月墨西哥杜蘭戈州圣胡安德爾里奧采集到的蜂花粉的代表。從牧豆樹花藥采得的花粉取自蜂房周圍的牧豆樹。憑證標本保存在CIIDIR的植物標本室，并經(jīng)植物標本室的植物學(xué)家Socorro Gonzalez鑒定。

2.2 顯微鏡檢測

采用顯微鏡分別檢測15份蜂花粉樣品的花粉顆粒以及5份采自花藥的花粉樣品的花粉顆粒，以確定花粉植物來源和均一性?；ǚ蹣悠范碱A(yù)先經(jīng)乙酸水解。實驗使用Olympus BX 40顯微鏡。

2.3 HPLC/DAD分析

采用高效液相色譜（二極管陣列檢測器）直接比較蜂花粉和采自花藥的花粉的酚類物質(zhì)分布情況，確定黃酮醇或酚酸的組成以及其植物來源，這一方法已有人提出過，蜂花粉用含水乙醇（50%，v/v，1 ml）超聲提取60 min，得到的渾濁液離心10 min，取上層清液做HPLC/DAD分析。采用Gylson 305 HPLC系統(tǒng)進行分析，進樣量 20 μl，Gylson 170 紫外檢測器；Waters Spherisorb S50D52（5 μm）色譜柱；乙腈-水體系（含酸）梯度洗脫；340 nm繪制譜圖。220～400 nm范圍內(nèi)用DAD檢測所有峰的光譜數(shù)據(jù)，采自花藥的花粉樣品按相同方法進行分析。根據(jù)Campos and Markham（2006）的方法進行結(jié)構(gòu)識別。

2.4 提取

按照2.2確定花粉粒的均一性以后，按2.3進行提取并檢測蜂花粉的酚類組成及植物來源。20 g花粉加入200 ml 50%含水乙醇（v/v）超聲提取5次，每次60 min，提取液離心10 min。合并所有上清液減壓蒸發(fā)至干即得到總提物?？偺嵛镉?0 ml 50%含水乙醇溶解，等分分裝，分別用于黃酮醇含量的檢測及抗氧化能力評估。

2.5 總提物中黃酮醇含量的確定

分別在不同濃度標品和樣品中添加氯化鋁，在425 nm波長下對每個試樣進行三次吸光值的測定，以樣品濃度（μl/ml）或標品濃度（μg/ml）對吸光值作圖進行線性回歸，通過對槲皮素標準曲線進行線性回歸分析來確定黃酮醇的含量，在1～50 μg/ml范圍內(nèi)槲皮素標準溶液的濃度與吸光值（425 nm）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 Abs425nm=-0.00221+0.054899（槲皮素），相關(guān)系數(shù)r=0.9973；在1～400 μl/ml（溶于50%乙醇）范圍內(nèi)樣品濃度與吸光值線性回歸的相關(guān)系數(shù)r為0.9989?；ǚ壑泻休^多黃酮醇，其含量以μg槲皮素/ml為單位。添加氯化鋁后，黃酮醇產(chǎn)生包括鄰位二羥基在內(nèi)的波長紅移，代表標準過程的重現(xiàn)。

2.6 對小鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化作用的抑制作用

采用硫代巴比妥酸法（TBARS）定量分析樣品對小鼠微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用，分析方法在Ohk awa等（1979）和 Uchiy ama，Mihara（1978）的基礎(chǔ)上進行了改進。硫代巴比妥酸反應(yīng)物的生成量反映了丙二醛（MDA）的含量（μg/L）。

選取CFI小鼠頸椎脫臼處死，取肝臟用冷生理鹽水漂洗后添加1.15%的冷KCl研磨得到濃度為10%的肝勻漿。微粒體制備參照Diczfalusy等（1996）的方法。微粒體蛋白分析采用Lowry的方法。反應(yīng)體系如下：100 μl微粒體上清液（86 μg 蛋白質(zhì)/ml）、待測樣品的不同等分試樣（0～100 μl）、50μl FeSO4和抗壞血酸的混合水溶液（含F(xiàn)eSO46.95 mg，抗壞血酸17.62 mg）、添加Tris-HCl緩沖液（10 mM，pH 7.4）至 500 μl，置具塞試管內(nèi)于37℃下孵育30 min，水冷卻，每管中加入3 ml 1%的磷酸和1 ml 0.6%的硫代巴比妥酸，沸水浴加熱45 min，冷卻后，加入4 ml正丁醇充分混勻，離心10 min分離醇相，然后在535 nm和520 nm波長下測定其吸光值，根據(jù)MDA在兩個波長下測得的吸光的差異來評價硫代巴比妥酸反應(yīng)物的濃度，選取4個濃度對參照物（槲皮素、槲皮苷和咖啡酸）進行測定。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制能力的大小以IC50值衡量（即抑制半數(shù)MDA生成所需要的抗氧化劑濃度，單位 μg/ml），IC50值通過MDA濃度與樣品黃酮醇濃度的線性回歸曲線來計算。每個待測物的等分試樣分別做三個平行分析。

2.7 抑制溴苯誘導(dǎo)小鼠模型的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)

誘導(dǎo)小鼠中毒參照Zhang和Shen（1997）的方法。80只雄性CFI小鼠（墨西哥Nacional de Virologia研究中心）隨機分成8組：一組作為實驗對照組用食用油喂食；一組用200 μl牧豆樹蜂花粉提取物喂食（黃酮醇濃度 C1=9.794 μg/ml）；一組用 200 μl牧豆樹蜂花粉提取物喂食（黃酮醇濃度 C2=21.751 μg/ml）；一組用 200 μl維生素E喂食（400UI）；一組以溴苯（200 μl，溴苯94.211 μg/ml食用油）誘導(dǎo)中毒；另外三組分別用維生素E（400UI）、C1或C2濃度的蜂花粉提取物喂食后再用溴苯致毒（200μl，溴苯94.211μg/ml食用油）。小鼠饑餓一宿后喂食抗氧化劑，30～60 min后溴苯致毒。

19～22 h后小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠的整個肝臟分別用冷生理鹽水漂洗，用1.15%的KCl勻漿制成10%的勻漿液。取500 μl的勻漿液采用硫代巴比妥酸法（TBARS）進行分析，方法參照2.6。用維生素E作為對照，以確定蜂花粉提取物的相對抗氧化率。每個勻漿液樣品做三組平行分析。

2.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用方差分析法分析（P≤0.05），均值經(jīng)鄧肯多重比較檢驗分析，結(jié)果由CASTAT計算機程序處理。

3 .結(jié)果和討論

3.1 顯微鏡檢測

顯微鏡檢測顯示蜂花粉粒在較大的程度上表現(xiàn)出均一性狀，這一結(jié)果肯定了Campos等（1997）和Almaraz-Abarca等（2004）的研究結(jié)果，即組成花粉的花粉粒大都來自同一品種。蜂花粉的花粉粒以及采自花藥的花粉粒的鏡檢直接比較結(jié)果顯示蜂花粉均來自牧豆樹。

3.2 HPLC/DAD分析結(jié)果

有文獻報道可通過直接比較蜂花粉與花藥花粉的酚類物質(zhì)HPLC/DAD分布情況來確認蜂花粉的植物來源。本文研究發(fā)現(xiàn)，蜂花粉的酚類物質(zhì)分布與采自牧豆樹花藥花粉的酚類物質(zhì)分布是一致的。在本實驗所采用的液相分析條件下，只檢測到了黃酮類化合物和肉桂酸衍生物。

表1牧豆樹花粉中的酚類成分（與墨西哥杜蘭戈州采集的牧豆樹蜂花粉中酚類成分一致）

牧豆樹花粉中含有黃酮苷，特別是芹菜素、槲皮素和異鼠李素的衍生物，還可能含有木犀草素和染料木黃酮，這些化合物都具有廣譜的生物活性。

3.3 體外實驗：預(yù)防肝微粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)

實驗根據(jù)牧豆樹蜂花粉乙醇提取物在硫代巴比妥酸實驗中對微粒體系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制能力來評價其抗氧化能力。測得的提取物及參照物（槲皮素、槲皮苷和咖啡酸）的IC50值見表2。

表2牧豆樹蜂花粉乙醇提取物及參照物的IC50值

在該實驗條件下，蜂花粉提取物有效的抑制了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其抗氧化能力高于參照物，甚至高于槲皮素的抗氧化力。Terao（1999）和 Okuda（1999）的實驗證明槲皮素是一種對抗脂質(zhì)過氧化的有效抗氧化劑。

每個種屬特有的黃酮和酚酸的組成及含量對確定不同種屬來源花粉的抗氧化能力有決定性的作用。有酚羥基的化合物在體外表現(xiàn)出很好的抗氧化能力，在B環(huán)的3'和4'位置上有二羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物抗氧化能力尤為突出。牧豆樹花粉中的木犀草素和槲皮素衍生物是具有該結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物。將牧豆樹蜂花粉與綠穗莧花粉、混合蜂花粉（由墨西哥杜蘭戈州的六種單一品種花粉混合而成）比較，在基本相同的實驗條件下它們在體外生物系統(tǒng)中的脂質(zhì)抗氧化能力不相上下，而這些花粉中黃酮類化合物的組成各不相同?？梢?，不同種屬來源以及不同黃酮組成的花粉也可能表現(xiàn)出類似的抗氧化能力。牧豆樹花粉、綠穗莧花粉和混合蜂花粉的抗氧化力均高于以下植物花粉：Rannunculus petiolaris（IC50=0.52 μg/ml）、萬壽菊（IC50=2.6 μg/ml）、Bidens odorata（IC50=3.6 μg/ml）、Solanum rostratum（IC50=5.9 μg/ml）和 Zea mays（IC50=16.2 μg/ml），而根據(jù)Almaraz-Abarca et al.（2004）報道的 IC50值，這些植物花粉的抗氧化力在蜂產(chǎn)品領(lǐng)域均極具代表性。

3.4 體內(nèi)實驗：預(yù)防溴苯誘導(dǎo)的小鼠肝損傷

在本研究中，我們通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量來衡量溴苯誘導(dǎo)致毒小鼠的肝損傷程度；在小鼠致毒前以牧豆樹花粉黃酮醇提取物喂食，評價兩個不同濃度提取物對溴苯誘導(dǎo)致毒小鼠的保護作用。結(jié)果見表3。

黃酮醇濃度為 C2（21.751 μg/ml）的總提物由于其自身的氧化性，使得它與實驗濃度的溴苯一樣對小鼠的肝臟具有致毒作用，分別產(chǎn)生了濃度為0.225 μg/ml和0.202 μg/ml的MDA，而以總黃酮濃度為C1（9.794 μg/ml）的總提物喂食的實驗組小鼠產(chǎn)生的MDA值（0.0107 μg/ml）低于實驗對照組。這兩個實驗結(jié)果表明，在未誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時，高濃度的牧豆樹花粉黃酮醇提取物對機體有害，因為它自身就是能一種能誘導(dǎo)肝損傷以及產(chǎn)生大量MDA的氧化劑。已有文獻報道多酚在某些特殊條件下對氧化反應(yīng)有促進作用，如給以瞬間高濃度金屬離子的刺激能誘使多酚促氧化。還有一些其他的氧化劑如抗壞血酸在體內(nèi)和體外系統(tǒng)有鐵離子存在時也能作為助氧化劑。1978年Chen和Chang發(fā)現(xiàn)幾內(nèi)亞豬肉中增添的抗壞血酸具有助氧化作用。對這一現(xiàn)象的解釋為：當生物分子中的鐵結(jié)合不緊密時抗壞血酸能促進生物分子（很可能是鐵蛋白）中鐵的釋放。而牧豆樹花粉總提物中高濃度黃酮類物質(zhì)（也有可能是其他成分）的體內(nèi)助氧化作用的機理還有待考察。在該體系中，可能存在一些其他因素對黃酮類化合物清除自由基有影響。

根據(jù)Rice-Evans的研究，酚類成分對氧化反應(yīng)的抑制作用可能與這些化合物能夠直接清除脂氧自由基和過氧自由基有關(guān)。高濃度的牧豆樹花粉黃酮提取物自身引起的助氧化作用與黃酮提取物在溴苯致毒模型中的抗氧化作用具有顯著差異，這一差異表現(xiàn)在：在第二組實驗（即抗氧化作用顯著的實驗組）中黃酮類化合物把氫傳遞給脂氧自由基和過氧自由基更具優(yōu)勢，所以黃酮類化合物起抗氧化作用而非助氧化作用。

表3樣品對溴苯誘導(dǎo)致毒小鼠肝臟的保護作用

在體內(nèi)實驗中，所有的牧豆樹蜂花粉提取物（黃酮醇濃度分別為21.751和9.794 μg/ml）都對溴苯引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)表現(xiàn)出了抗氧化作用。低濃度黃酮醇的提取物使脂質(zhì)氧化減少了19.4%；高濃度黃酮醇的提取物使脂質(zhì)氧化減少了32.1%。結(jié)果表明，牧豆樹蜂花粉提取物中黃酮醇的濃度與其抗氧化能力具有一定的關(guān)系。但是，所有提取物在體內(nèi)的抗氧化力都比維生素E要低（維生素E為88.08%），可能是因為槲皮素對鏈式脂質(zhì)過氧化自由基的清除率顯著低于維生素E，且花粉提取物的各成分間也并未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。我們的實驗結(jié)果不同于Zhang和Shen（1997）報道的茶多酚與維生素E在體內(nèi)具有相同的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制力。

由于未進行更深入的研究，目前也還沒有關(guān)于花粉提取物體內(nèi)抗氧化力的其他數(shù)據(jù)，所以未對不同種屬來源的花粉的抗氧化力進行比較。但基于我們使用相同的MDA-TBA的方法對牧豆樹花粉提取物脂質(zhì)氧化抑制力的評價，可以比較這一種屬花粉體外生物系統(tǒng)和體內(nèi)系統(tǒng)的抗氧化力的差異。研究表明，在體外系統(tǒng)中牧豆樹蜂花粉提取物脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制力為0.07 μg/ml（以IC50值表示）。即在無氧化劑存在的情況下，每降低50%的MDA的生成需要牧豆樹花粉的黃酮醇濃度為0.07 μg/ml，而體內(nèi)系統(tǒng)中黃酮醇濃度為21.751 μg/ml的提取物僅能降低32%的MDA生成量。

4 結(jié)論

牧豆樹蜂花粉的乙醇總提物作為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制劑具有顯著作用，可以視為氧化應(yīng)激的外源性防衛(wèi)，盡管其活力低于維生素E，同樣也低于其在體外肝微粒體生物系統(tǒng)中表現(xiàn)出來的活力。牧豆樹花粉酚類化合物組成獨特，是一種重要的天然抗氧化劑來源。從黃酮醇濃度和抗氧化力的關(guān)系可以看出，牧豆樹蜂花粉中的黃酮醇類化合物對其抗氧化力有一定影響。體外生物系統(tǒng)中抗氧化能力并不代表真實的體內(nèi)活動，所以對體內(nèi)抗氧化活動做更進一步的研究非常有必要。在未誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的情況下，高濃度黃酮醇的牧豆樹蜂花粉提取物可以視為體內(nèi)氧化劑。