龐耀珊，謝芝勛，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，劉加波，范 晴

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

禽流感病毒（Avian inf l uenza virus， AIV）屬于A型流感病毒，能廣泛感染包括鳥類和哺乳動(dòng)物在內(nèi)多種動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重疾病綜合癥[1-11]。至今為止，已發(fā)現(xiàn)了16個(gè)血凝素（HA）和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶（NA）亞型[12-13]。不同亞型之間禽流感病毒的致病性是不同的。其中，H5亞型為高致病性亞型，歷史上多起與H5亞型相關(guān)的禽流感疫情爆發(fā)，除了造成禽類大規(guī)模死亡外，對(duì)人畜也造成了不同程度的威脅。特別是近年來(lái)在亞洲地區(qū)爆發(fā)的H5N1亞型禽流感，在肆虐該地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的同時(shí)，也引發(fā)了多起人畜感染發(fā)病、甚至死亡的事件 ，凸現(xiàn)了該病的重要公共衛(wèi)生意義[2-6]。AIV是一種極易傳播的病原，感染禽類的流動(dòng)及其與其它動(dòng)物密切接觸是禽流感傳播的一個(gè)重要因素[14-17]。研究開發(fā)有效的診斷試劑和診斷技術(shù)對(duì)該病的有效防控具有重要意義[18-22]。

研究表明，HA蛋白是AIV最主要的表面抗原糖蛋白，與病毒的抗原性和致病性直接相關(guān)[23-24]，在AIV的病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷中扮演著重要角色[19-22，25]。

在AIV單克隆抗體制備技術(shù)中，免疫抗原主要包括以下3大類：純化病毒、病毒亞單位及重組表達(dá)蛋白[25-31]。純化病毒和病毒亞單位作為抗原制備單克隆抗體時(shí)，需要涉及病毒培養(yǎng)、滅活和純化等過(guò)程。特別是H5亞型AIV是一種高致病性亞型，具有潛在的生物安全危害，需要在授權(quán)的特定實(shí)驗(yàn)室并在特殊條件下才能生產(chǎn)，抗原來(lái)源受到嚴(yán)格控制，在一定程度上限制了該病診斷技術(shù)研究的進(jìn)程。為此，十分有必要探索一條安全可靠的抗原制備及診斷試劑開發(fā)途徑，為相關(guān)診斷技術(shù)的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

抗原表位又稱抗原決定簇（antigenic determinant，AD），是抗原物質(zhì)中激活淋巴細(xì)胞，引起機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)，它決定著抗原的特異性。為了解決H5亞型AIV抗原及其單克隆抗體生產(chǎn)難題，本研究擬利用H5N1亞型禽流感病毒的HA抗原表位重組表達(dá)蛋白為免疫抗原，通過(guò)雜交、篩選，獲取針對(duì)該抗原表位的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)該細(xì)胞株所生產(chǎn)的單克隆抗體的主要特性及其可用性進(jìn)行初步研究。為H5亞型AIV抗原制備及單克隆抗體制備探索的一條安全可靠的途徑，打破該病檢測(cè)技術(shù)研究開發(fā)的瓶頸，對(duì)H5亞型禽流感的防控有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)條件

1.1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性重組菌 H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性重組菌Rosetta-gami B （DE3）/pET-32a（+）-HA，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白大小為48.1kD。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 12只8～10周齡健康BALB/c鼠，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0，由美國(guó)賓夕法尼亞州州立大學(xué)動(dòng)物診斷中心Dr. Lu惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要藥品試劑 福氏完全佐劑及不完全佐劑、改良RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），GIBCO公司產(chǎn)品；氨基蝶呤（Aminopterin）、次黃嘌呤（Hypoxanthine）、胸腺嘧啶核苷（Thymidine）、PEG-1000，Sigma公司產(chǎn)品，分別配制成含氨基蝶呤4×10-5mol/L的A儲(chǔ)存液、含次黃嘌呤1×10-2mol/L和含胸腺嘧啶核苷1.6×10-3mol/L的HT儲(chǔ)存液、50%PEG儲(chǔ)存液，-20℃保存。羊抗鼠免疫球蛋白亞類分型試劑盒（SBA Cloningtyping System/HRP），購(gòu)自SouthernBiotech公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG及羊抗雞IgG，購(gòu)自KPL公司。H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和SPF陰性雞血清，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

他爸臉色精彩極了，我媽的表情更精彩，巴掌再次拍拍落在我身上，我捂著屁股亂叫，一人做事一人當(dāng)，你們懂個(gè)屁。

1.1.4 試驗(yàn)儀器 KHB ST-360酶標(biāo)儀，上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.2 設(shè)計(jì)思路 利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的H5亞型AIV HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性重組菌Rosettagami B （DE3）/pET-32a（+）-HA在體外進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得重組蛋白包涵體。利用重組蛋白上組氨酸標(biāo)簽對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行純化。純化蛋白與福氏佐劑混合制備成抗原，免疫8～10周齡健康BALB/c鼠。多次免疫后，取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞株。以純化重組表達(dá)蛋白為抗原建立間接ELISA，并用該方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行多次篩選，得到分泌相應(yīng)單克隆抗體的細(xì)胞株。利用有限稀釋法對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，獲得純化的單克隆細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞株，腹腔注射小鼠3只生產(chǎn)腹水。分別測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)及其基本特性，最后通過(guò)免疫阻斷試驗(yàn)評(píng)估該單克隆抗體的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HA抗原表位重組蛋白的制備及純化 將含有H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性重組菌Rosetta-gami B（DE3）/pET-32a（+）-HA接種到5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，再按10%的接種量接種到500 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600吸光值，當(dāng)吸光值達(dá)到0.5～0.8之間的任何一個(gè)值時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑，繼續(xù)在37 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜，獲得細(xì)菌懸液，2500×g離心10 min，收集菌體沉淀。用10 mL的PBS溶液重懸，取5μL菌體懸液按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)表達(dá)結(jié)果（目的重組蛋白大小約48.1 kD）；其余懸液加入終濃度為100 μg/mL的溶菌酶，在冰上進(jìn)行超聲波裂解，10000×g離心5 min收集包涵體沉淀。利用QIAexpress Ni-NTA Fast Sart His標(biāo)簽重組蛋白純化試劑盒，按說(shuō)明對(duì)His標(biāo)簽重組蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物置-70 ℃保存?zhèn)溆?。? μL純化產(chǎn)物按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和WesternBlot，并用H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性雞血清和SPF陰性雞血清進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2 單克隆抗體檢測(cè)方法的建立 用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化蛋白的濃度，參考秦春香[32]方法，根據(jù)ELISA技術(shù)原理，利用方陣試驗(yàn)，將重組蛋白稀釋成不同濃度包被ELISA板，測(cè)定小鼠陽(yáng)性血清的OD450吸光值。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.3.3.1 小鼠免疫 加入福氏完全佐劑制備成200 μg/mL的免疫抗原，參考文獻(xiàn)[25，31]方法，皮下分點(diǎn)注射8-10周齡健康BALB/c鼠，0.5 mL/只。以后每隔14天，用福氏不完全佐劑制備的抗原再免疫2次。細(xì)胞融合前3天通過(guò)腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。

1.3.3.2 細(xì)胞融合及篩選 參考文獻(xiàn)[31]，無(wú)菌剖殺小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，利用PEG融合試劑將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。融合10天后，收集雜交瘤細(xì)胞上清液，以SP2/0細(xì)胞上清液和免疫小鼠陽(yáng)性血清分別作陰性和陽(yáng)性對(duì)照，用所建立的HA抗原表位重組蛋白ELISA檢測(cè)方法雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行鑒定。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行多次傳代純化，直到得到穩(wěn)定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，液氮保存。

1.4 單克隆抗體的制備 將得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成5×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。參考文獻(xiàn)[31]方法，先提前1天對(duì)9只8～10周齡健康BALB/c小鼠腹腔注射福氏不完全佐劑，劑量為0.1 mL/鼠，1天后再通過(guò)小鼠腹腔注射上述新鮮制備的雜交瘤細(xì)胞懸液1 mL/鼠。注射后每天觀察小鼠腹腔變化，待小鼠腹部明顯膨大后，剖腹采集腹水，10000×g離心3 min，收集上清，用間接ELISA方法測(cè)定腹水的單克隆抗體效價(jià)，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 Ig亞類鑒定 收集陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞上清液，利用羊抗鼠免疫球蛋白亞類分型試劑盒（SBA Cloningtyping System/HRP），按試劑盒說(shuō)明對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體Ig類型和輕鏈類型進(jìn)行分型鑒定。

1.5.2 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測(cè)定 凍存的雜交瘤細(xì)胞在液氮中凍存3個(gè)月和6個(gè)月后進(jìn)行復(fù)蘇，分別連續(xù)傳5代，收集細(xì)胞上清液，用本研究所建立的間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 單克隆抗體特異性測(cè)定 腹水單克隆抗體稀釋2000倍后分別與固定于硝酸纖維素膜上的H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性抗原、新城疫病毒（NDV）陽(yáng)性抗原、傳染性支氣管炎病毒（IBV）陽(yáng)性抗原、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒（EDS）陽(yáng)性抗原按常規(guī)方法進(jìn)行WesternBlot免疫印跡試驗(yàn)，同時(shí)以SP2/0細(xì)胞上清、未免疫小鼠陰性血清、SPF雞血清作陰性對(duì)照，陽(yáng)性鼠血清和H5N1陽(yáng)性雞血清作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)單克隆抗體的特異性。

1.6 免疫阻斷試驗(yàn) 用辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記腹水單克隆抗體，將H5N1亞型禽流感病毒陽(yáng)性雞血清稀釋100倍后，加入到1.5方法中建立的HA抗原表位重組表達(dá)蛋白包被的ELISA板中，37 ℃作用1 h，再加入1×104倍稀釋的HRP標(biāo)記的腹水單克隆抗體，37 ℃作用30 min，顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的OD450吸光值。試驗(yàn)同時(shí)用SPF雞血清代替H5N1亞型禽流感病毒陽(yáng)性雞血清作陰性對(duì)照。每份樣品重復(fù)測(cè)試3次。根據(jù)公式X+3STD計(jì)算出陽(yáng)性判定值，公式中的X為陰性對(duì)照樣品OD450的平均值，STD為陰性對(duì)照樣品方差。當(dāng)待檢樣品的OD450平均值≤陽(yáng)性判定值時(shí)，判定待檢樣品阻斷陽(yáng)性，反之為陰性。

2 結(jié)果

2.1 HA抗原表位重組蛋白的制備及純化結(jié)果 含有H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性重組菌Rosetta-gami B（DE3）/pET-32a（+）-HA經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，在48.1 kD處出現(xiàn)豐度較高的重組表達(dá)蛋白，重組蛋白包涵體經(jīng)his標(biāo)簽純化后能與H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性雞血清起特異性反應(yīng)，與SPF陰性雞血清無(wú)反應(yīng)，見圖2 WesternBlot免疫印跡結(jié)果。

2.2 單克隆抗體檢測(cè)方法的建立結(jié)果 以不同濃度的純化重組蛋白為抗原包被ELISA板，通過(guò)方陣試驗(yàn)測(cè)試，建立了以15 μg/mL蛋白濃度為包被抗原的H5亞型禽流感病毒HA抗原表位單克隆抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果 多次免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)篩選，獲得1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株多次克隆純化后，命名為W2-2。

2.4 單克隆抗體的制備結(jié)果 W2-2細(xì)胞株腹腔注射小鼠后，小鼠于第10天左右腹部明顯膨大，平均每只小鼠采集到約8 mL腹水。經(jīng)測(cè)定，離心處理后的腹水上清單克隆抗體的ELISA效價(jià)達(dá)1:5×104。

2.5 單克隆抗體特性鑒定結(jié)果

2.5.1 Ig亞類鑒定結(jié)果 經(jīng)鑒定，雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體亞類為IgM、輕鏈類型為IgK亞類。

2.5.2 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 在液氮中凍存了3個(gè)月和6個(gè)月后的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)本研究所建立的間接ELISA檢測(cè)方法測(cè)定，其傳代細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌特定單克隆抗體。

2.5.3 單克隆抗體特異性測(cè)定結(jié)果 腹水單克隆抗體稀釋2000倍后與不同禽病抗原WesternBlot免疫印跡結(jié)果如表1及圖3所示。從表1中結(jié)果可見，本研究所制備的單克隆抗體只與H5亞型禽流感病毒陽(yáng)性抗原起反應(yīng)，與供試的其它禽病陽(yáng)性抗原無(wú)反應(yīng)，結(jié)果與小鼠陽(yáng)性血清及雞H5N1血清試驗(yàn)結(jié)果一致；SP2/0細(xì)胞上清、未免疫小鼠陰性血清、SPF雞血清與供試的上述各種抗原均無(wú)反應(yīng)。

表1 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

2.6 免疫阻斷試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果如表2所示，SPF陰性血清100倍稀釋后，3次重復(fù)試驗(yàn)的OD450平均值為0.252，STD值為0.033，根據(jù)公式X+3STD計(jì)算出其陽(yáng)性判定值為0.352。H5N1禽流感病毒陽(yáng)性雞血清100倍稀釋后所測(cè)得的3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果平均值為0.152，小于陽(yáng)性判定值0.352，判定為阻斷試驗(yàn)陽(yáng)性。

表2 免疫阻斷試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

單克隆抗體是由B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤單克隆細(xì)胞分泌合成的針對(duì)一種特定抗原決定簇的抗體，具有來(lái)源方便、穩(wěn)定性高、均一性好、濃度高等優(yōu)點(diǎn)，可用作病原或血清學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑[25-31]。

H5N1禽流感病毒基因組由8個(gè)RNA節(jié)段組成，共編碼11種病毒蛋白，抗原成分復(fù)雜，所包含的抗原決定簇?cái)?shù)量龐大。利用提純病毒免疫小鼠時(shí)，可能會(huì)得到針對(duì)各種抗原成份的單克隆抗體，給單克隆抗體的篩選帶來(lái)一定困難[28-30]。

本研究利用重組表達(dá)蛋白為抗原制備單克隆抗體，抗原來(lái)源方便，純化方法簡(jiǎn)單，與純化病毒制備方法相比，更易于得到特定抗體種類單一的雜交瘤細(xì)胞株[30]。如圖2 WesternBlot免疫印跡結(jié)果和雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果所示，重組表達(dá)蛋白可以作為ELISA包被抗原直接對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選，簡(jiǎn)化了單克隆抗體的篩選工作。

本研究所建立的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，在液氮中保存3個(gè)月和6個(gè)月后再?gòu)?fù)蘇，經(jīng)多次傳代仍能穩(wěn)定分泌針對(duì)H5亞型AIV HA抗原表位蛋白的單克隆抗體，其ELISA效價(jià)高達(dá)1:5×104。WesternBlot免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究制備的單克隆抗體具有高度特異性。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗原的不同可以分為IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 5種類型。資料表明[33-34]，IgM具有參與凝集反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的特性。本研究所制備的單克隆抗體為具有IgK輕鏈的IgM亞類，提示這些單克隆抗體同樣具有凝集反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)活性，可以作為檢測(cè)試劑應(yīng)用于下一步相關(guān)檢測(cè)技術(shù)中。本研究的免疫阻斷試驗(yàn)結(jié)果也初步驗(yàn)證了這一推斷。

4 結(jié)論

本研究成功探索出一套利用H5亞型AIV HA抗原表位重組表達(dá)蛋白制備單克隆抗體的方法，該方法與純化病毒制備方法相比，更加簡(jiǎn)便、高效，打破了H5亞型AIV檢測(cè)技術(shù)研究的局限性。

致謝：感謝美國(guó)賓夕法尼亞州州立大學(xué)動(dòng)物診斷中心的Dr. Lu Hua-guang贈(zèng)送的骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0；感謝南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司的謝體三博士對(duì)本研究提供支持和幫助。

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