黃永亮，施赫赫，馮順意，王怡飛，米政實(shí)，劉慧思，徐曉娟，張 瑩，吳曉薇,2，牛學(xué)鋒,3，郭霄峰*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 廣東廣州510642；3.Department of Veterinary Pathology,Athens,GA 30602)

犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)是細(xì)小病毒科(Parvoviridate)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)的成員，為單股無囊膜的DNA病毒，基因組全長約5.0kb[1]。1978年美國學(xué)者Eugster和Nairn首次從患有腸炎的病犬體內(nèi)分離獲得CPV，其后，加拿大、澳大利亞、法國、日本等國均有該病發(fā)生的報(bào)道?；疾∪試I吐、出血性腸炎及白細(xì)胞減少為主要特征，幼犬對CPV的易感性高，可以引起幼犬的心肌炎，因此CPV的感染對養(yǎng)犬業(yè)和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)危害很大[2-3]。CPV不斷通過抗原漂移產(chǎn)生新的突變株，宿主范圍不斷擴(kuò)大。先前的CPV-2株已發(fā)展為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)4個(gè)不同的亞型[4-6]。我國流行株主要以CPV-2a為主，南方地區(qū)CPV-2b也有流行。

CPV疫苗對該病的控制起到了積極的作用，但疫苗的使用導(dǎo)致的抗原漂移產(chǎn)生新突變株，疫情控制仍然不理想，主要流行株有待進(jìn)一步分析。本研究通過在廣州及深圳地區(qū)各大動(dòng)物醫(yī)院采集疑似CPV感染犬只的糞便，接種于F81細(xì)胞分離病原并結(jié)合PCR檢測、血凝試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)等驗(yàn)證分離株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所分離的19個(gè)病毒株均為CPV。

1 材料和方法

1.1 病料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞 疑似CPV感染犬的糞便樣品采自廣州和深圳各寵物醫(yī)院；2月齡比格犬購自廣州醫(yī)藥工業(yè)研究所增城比格犬場；F81細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及引物 2×PCR M ix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)材料購自GIBCO公司；檢測引物參考文獻(xiàn)[7]的序列檢測CPV VP2基因保守區(qū)域的引物P1和P2，預(yù)期擴(kuò)增片段為 585bp，P1：5'-TGTAAGCTTCCAGGAGAC T-3'；P2：5'-ATAACCTGGAGGCACAAGT-'3，由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 CPV DNA的提取 采用常規(guī)的苯酚/氯仿方法提取CPV的DNA。

1.4 CPV的PCR檢測 PCR反應(yīng)體系：12.5μL 2×PCR M ix、1μL P1、1μL P2、2μL模板 DNA、ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s、45℃ 30s、72℃ 45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10m in。PCR產(chǎn)物由上海英俊生物科技有限公司測序，再在NCBI上進(jìn)行在線Blast分析。

1.5 病原分離 病料以PBS制成1∶8懸液，混勻后離心取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，接種于F81細(xì)胞，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照。每天觀察細(xì)胞貼壁生長情況和細(xì)胞病變(CPE)。待出現(xiàn)80%病變(約4d)時(shí)收毒。

1.6 病毒核苷酸同源性分析與進(jìn)化樹繪制 從GenBank下載CPV VP2基因序列與本研究中VP2基因在DNAStar進(jìn)行序列比對并繪制進(jìn)化樹。

1.7 血凝試驗(yàn)(HA)與組織半數(shù)感染量(TCID50)分析取疑似CPV樣品處理液以及第5代細(xì)胞培養(yǎng)物采用1%豬紅細(xì)胞進(jìn)行HA試驗(yàn)。將CPV的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物作10倍倍比稀釋，取10-7、10-6、10-5和10-44個(gè)稀釋度分別接種于6瓶F81細(xì)胞懸液內(nèi)，每瓶1m L。于37℃培養(yǎng)96h，觀察CPE，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將4只試驗(yàn)用比格幼犬隨機(jī)分2組，隨機(jī)選擇HA效價(jià)達(dá)28并且為CPV-2a亞型病毒株，在攻毒組分別由皮下注射3m L和口服7m L CPV-s5細(xì)胞培養(yǎng)病毒液；對照組分別皮下注射及口服相應(yīng)劑量的生理鹽水。各組分開飼養(yǎng)，每天觀察臨床表現(xiàn)，記錄各種變化。

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測結(jié)果與測序分析 利用特異性引物對病犬的糞便樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到(19/32)與預(yù)期片段(585bp)相符的目的條帶(圖1)。PCR產(chǎn)物核苷酸測序結(jié)果表明，所得病毒序列為CPV序列。對測定的VP2基因部分序列進(jìn)行BLAST比對，繪制進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，相互之間的同源性達(dá)97%～99.5%，其中CPV-s5與北京株(EF666062、EF666067、EU145955)具有較高的同源性，CPV-s8和CPV-s10則與杭州株(EU213081)、深圳株(EU170352)有較高的同源性，CPV-s2和CPV-g13與北京株(EU145959)有較高的同源性，CPV-s6、CPV-g5和CPV-g11與泰國株(GQ379042、GQ379045、GQ379048)具有較高的同源性，CPV-g15與杭州株(EU213078、長春株(GU380303)具有較高的同源性，CPV-g4、CPV-g6、CPV-g7和CPV-g12與杭州株(EU483516)具有較高的同源性，而CPV-g1則與山東株(GQ857605、GQ857608)具有較高的同源性(圖 2)。CPV-2與CPV-2a在VP2蛋白有5個(gè)氨基酸發(fā)生了突變(Met-87突變?yōu)長eu、Ile-101突變?yōu)門hr、Ala-300突變?yōu)?Gly、Asp-305突變?yōu)?Tyr和 Val-555突變?yōu)镮le)；CPV-2a與CPV-2b的區(qū)別主要有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)(Asn-426突變?yōu)?Asp和 Ile-426突變?yōu)?Val)；而CPV-2c與CPV-2b的區(qū)別主要在426位氨基酸(Glu-426突變?yōu)锳sp)[8]。由推導(dǎo)氨基酸序列顯示，所分離的19份陽性樣品中，16份為CPV-2a亞型(CPV-g4、 CPV-g5、 CPV-g6、 CPV-g7、 CPV-g11、CPV-g12、 CPV-g13、 CPV-s2、 CPV-s3、 CPV-s4、CPV-s5、 CPV-s6、 CPV-s7、 CPV-s8、 CPV-s9、CPV-s10)，1份為CPV-2b亞型(CPV-1130)，2份為CPV-2c 亞型(CPV-g1、CPV-g15)。

圖1 PCR檢測結(jié)果Fig.1Results of PCR

圖2 VP2基因同源性進(jìn)化樹Fig.2Phylogenetic tree of VP2genes of CPV

2.2 病毒分離與培養(yǎng) 第3代病毒在F81細(xì)胞中培養(yǎng)96h左右開始出現(xiàn)腫脹、圓縮、凝聚成團(tuán)或絮狀脫落，并在細(xì)胞核內(nèi)形成圓形和橢圓形嗜酸性、大小不等的包涵體。

2.3 血凝效價(jià)與TCID50的檢測 檢測的樣品處理液中，19份樣品血凝價(jià)為1∶256、12份樣品為陰性。在第5代細(xì)胞培養(yǎng)液中，除CPV-1130為陰性，其余分離株均達(dá)到1∶256。

病毒培養(yǎng)至第5代，在F81細(xì)胞中測定各病毒株的TCID50，結(jié)果顯示，所有病毒株均在10-6左右(表 1)。

表1 病毒HA效價(jià)與TCID50(/0.1m L)Table 1HA titer and TCID50(/0.1m L)of CPV

2.4 動(dòng)物試驗(yàn) 以CPV-S5的培養(yǎng)物分別口服和皮下接種CPV陰性的比格犬，攻毒后2d即發(fā)現(xiàn)犬只血便、食欲減退、嘔吐、發(fā)熱、被毛凌亂無光澤，第5d死亡。剖檢可見腸管壁有大量的出血點(diǎn)，腸粘膜出血；胃粘膜破損、有出血點(diǎn)；脾臟表面粗糙、干燥、無彈性，有大量淤血壞死灶；肝臟有大量的出血點(diǎn)及淤血壞死灶。取糞便做PCR檢測，結(jié)果呈陽性；血凝效價(jià)為27。從以上的特征性臨床癥狀、病理解剖及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果表明該回歸試驗(yàn)成功，試驗(yàn)犬為CPV感染致死。

3 討 論

CPV可在MDCK、BHK21、Vero、F81等多種傳代細(xì)胞中進(jìn)行增殖，但只在F81細(xì)胞中增殖時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞圓縮、脫落等明顯的病變[9]。本研究曾在MDCK、BHK21、Vero、BHK-21細(xì)胞進(jìn)行分離，MDCK細(xì)胞中雖有病變，但CPE不明顯，效果不理想，而F81細(xì)胞分離可見明顯CPE，與之前的研究結(jié)果一致[10]。原因可能是因?yàn)椴煌?xì)胞系的表面受體不一致，抗損傷能力不同以及CPV對不同細(xì)胞系的敏感性不同造成的。CPV的DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，其復(fù)制過程出現(xiàn)于細(xì)胞周期的S期，完全依賴宿主DNA聚合酶及其復(fù)制體系進(jìn)行復(fù)制。因此，該病毒的接種最好采用同步接種方式。本研究將分離株同步接種F81，CPE出現(xiàn)較規(guī)律，即接毒后4d細(xì)胞開始圓縮、凝集成團(tuán)或絮狀脫落。

CPV有較強(qiáng)的血凝特性，能夠凝集豬和恒河猴的紅細(xì)胞。也有文獻(xiàn)報(bào)道，CPV也可以凝集貓、馬和倉鼠的紅細(xì)胞。國外有報(bào)道應(yīng)用硼酸緩沖液處理CPV，也能凝集犬和綿羊的紅細(xì)胞，但不能凝集牛、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、雞、鵝和人的O型紅細(xì)胞。HA-HI于1980年正式用于CPV的檢測。雖然該方法簡單、敏感、可靠、經(jīng)濟(jì)，可以迅速檢出糞便提取物或細(xì)胞培養(yǎng)物中的CPV抗體，但結(jié)果不穩(wěn)定，特別是對感染后期檢測的準(zhǔn)確率較低。為檢出后期糞便中出現(xiàn)的IgM等抗體，以及被此種抗體凝集失去血凝活性的CPV抗原，可以采用2-巰基乙醇對檢測的樣品進(jìn)行處理，提高陽性檢出率。通過對HA-HI試驗(yàn)條件進(jìn)行全面優(yōu)化，可大大地提高陽性檢出率與準(zhǔn)確率[11]。本研究曾以傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測，但檢出率較低；運(yùn)用改良后的方法，獲得了較為穩(wěn)定的、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

一般認(rèn)為，CPV是FPV或FPV樣病毒通過基因突變而產(chǎn)生。自20世紀(jì)70年代末在美國分離到CPV，之后迅速呈現(xiàn)全球流行分布，為了與之前發(fā)現(xiàn)的犬細(xì)小病毒-犬極小病毒區(qū)分，命名為CPV-2[12]。我國于1983年正式報(bào)道了該病的流行。從CPV的報(bào)道來看，1979年～1985年間以傳統(tǒng)的CPV-2亞型為主，隨后被CPV-2a亞型替代，繼而CPV-2a亞型發(fā)生點(diǎn)突變又出現(xiàn)了新的亞型CPV-2b，很快在全球范圍內(nèi)流行，形成CPV-2a和CPV-2b共存的流行分布。2000年后，意大利、德國、西班牙、英國、越南和南美洲等出現(xiàn)新的流行亞型CPV-2c[13]，2010年有報(bào)道我國出現(xiàn)CPV-2c亞型病毒株[14]。我們的調(diào)查研究顯示，CPV-2a基因亞型依然是珠三角地區(qū)主要流行亞型(其中，深圳分離株相互之間的差異很小，均與CPV-2a基因亞型達(dá)到99%以上，而廣州分離株則差異稍大)，但CPV-2b亞型(廣州分離株CPV-1130)也存在，并且有向新的CPV-2c亞型(廣州分離株CPV-g15)進(jìn)化的趨勢。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c在珠三角地區(qū)共存，但以CPV-2a亞型為主要優(yōu)勢流行病毒株。

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