秦風(fēng)彥，劉 燕，韋 強(qiáng)，肖琛聞，鮑國(guó)連*，季權(quán)安，姚火春

(1.浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095)

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)由Ferry于1922年首次從兔體中分離到，該菌可導(dǎo)致哺乳仔兔和斷乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎，可以引起豬的萎縮性鼻炎、犬傳染性支氣管炎等，并且可以感染人，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重并且具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[1]。目前，預(yù)防該病的疫苗效果普遍不理想，丞待尋找新的疫苗候選成分。Bb的外膜蛋白(Outermembrane proteins，OMPs)在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息識(shí)別、細(xì)胞吸附等方便具有重要的作用，具有良好的免疫原性，作為疫苗候選抗原具有良好前景[2-3]。雙向電泳(2-DE)技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量不同，通過(guò)兩次電泳進(jìn)行蛋白分離，是對(duì)蛋白質(zhì)組分辨率高、重復(fù)性好的分離技術(shù)。本研究利用碳酸鈉法提取兔Bb的OMPs，采用2-DE提取的蛋白進(jìn)行分離，通過(guò)對(duì)裂解液、上樣量、聚焦條件等進(jìn)行優(yōu)化，獲得了聚焦良好、分離清晰的Bb的OMPs圖譜，為進(jìn)一步研究Bb的OMPs奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌 株 Bb菌株由浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑和儀器 IpG干膠條和IpG緩沖液(pH3～10、pH4～7)、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、CHAPS、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor)、蛋白定量試劑盒均購(gòu)自GE Healthcare公司；SB3～10購(gòu)自Sigma公司；Ettan IPGphorⅢ等電聚焦儀、SE600Ruby標(biāo)準(zhǔn)垂直電泳系統(tǒng)、Image scanner掃描成像系統(tǒng)均為GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.3 樣品制備 采用碳酸鈉法提取OMPs[4-6]。Bb菌株劃線(xiàn)接種于綿羊血平板，挑取單菌落至TSB中，37℃培養(yǎng)16h，4℃離心收集菌體，用預(yù)冷的低鹽PBS洗4次，加入50mM pH7.5Tris-Cl重懸菌體，同時(shí)加入1%蛋白酶抑制劑，冰浴中超聲裂解25m in(SONICSVC 750、2W、脈沖 2s、間隔 2s)，使OD600nm下降到初始值的1/l0。4℃ 9000r/min離心10m in取上清加入10倍體積冰預(yù)冷的0.1M Na2CO3(pH11)，冰浴中緩慢攪拌1h。4℃100000r/m in離心1h，將蛋白沉淀用50mM pH7.5Tris-Cl重懸沉淀后4℃，100000r/m in離心1h，棄上清，用裂解液Ⅰ(5M Urea、2M Thiourea、4%CHAPS、0.28%DTT)或裂解液 Ⅱ(5M Urea、2M Thiourea、2%CHAPS、2%SB3-10、l%DTT)溶解后分裝，測(cè)定蛋白濃度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 第一向等電聚焦(IEF) 分別用裂解液Ⅰ和裂解液Ⅱ溶解OMPs，采用pH3～107cm IPG膠條，上量樣為140μg，IEF程序?yàn)棰?；裂解液Ⅱ溶解OMPs，分別采用 pH3～10、pH4～713cm 的 IPG膠條，上樣量為750μg，IEF程序?yàn)棰螅涣呀庖孩蛉芙釵MPs，pH4～713cm的IPG膠條，上樣量分別 為 650μg、750μg、950μg，IEF 程 序 為 Ⅲ ；pH4～713cm的IPG膠條，裂解液Ⅱ溶解OMPs，上樣量為75μg，IEF程序?yàn)棰?。將蛋白樣品采用水化?7M Urea、2M Thiourea、4%CHAPS、0.4%DTT、0.5%IPG buffer、痕量溴酚藍(lán))補(bǔ)足至終體積125μL或250μL，主動(dòng)水化12h后進(jìn)行等電聚焦，7cm pH3～10聚焦程序Ⅰ為：300V，200Vhrs，1000V，300Vhrs，5000V，4000Vhrs，5000V，1250Vhrs，總電壓時(shí)間積(Total)為 5751Vhrs；13cm聚焦程序Ⅱ?yàn)椋?00V，1h，500V，2h，1000V，1h，8000V，2∶30h，8000V，0∶55h，Total為 20000Vhrs；或聚焦程序Ⅲ 500V，2h，1000V，1h，8000V，2∶30h，8000V，4h，Total為41000Vhrs。聚焦結(jié)束后，取出膠條，-70℃保存或直接進(jìn)行平衡。

1.5 第二向SDS-PAGE電泳 聚焦電泳后的IPG膠條在平衡緩沖液Ⅰ(6M Urea，75mM pH8.8Tris-HCl、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚藍(lán)、1%DTT)中于搖床上振蕩平衡15m in，然后在平衡緩沖液Ⅱ(6M Urea、75mM pH8.8Tris-HCl、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚藍(lán)、1%DTT、2.5%IAA)中再平衡15min。第二向SDS-PAGE電泳在mini VE或SE600Ruby垂直電泳儀上進(jìn)行，電泳結(jié)束后，膠體考馬斯亮藍(lán)[7]或PlusOne銀染試劑盒染色。

1.6 凝膠圖像的掃描 使用Imagescanner掃描儀和Labscan掃描軟件以及Imagemaster 2D Platinum 7.0凝膠分析軟件對(duì)凝膠進(jìn)行掃描成像并分析，分辨率設(shè)置為600ppi。

2 結(jié) 果

2.12 -DE條件優(yōu)化

2.1.1不同裂解液對(duì)蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響采用7cm pH3～10IPG膠條，上量樣為 140μg，IEF程序?yàn)棰?，考馬斯亮藍(lán)染色，分別用裂解液Ⅰ和裂解液Ⅱ溶解OMPs，2-DE圖譜見(jiàn)圖1。雖然兩者的蛋白上樣量均不足，但含SB3-10的裂解液獲得的蛋白點(diǎn)較多。

2.1.2不同pH范圍對(duì)蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，上樣量為750μg，IEF程序?yàn)棰?，考馬斯亮藍(lán)染色，分別用13cm pH3～10、pH4～7IPG膠條，2-DE圖譜見(jiàn)圖2。蛋白點(diǎn)主要集中在pH4～7的范圍內(nèi)，而且酸性端蛋白較集中，為了獲得更好的分離率，采用pH4～7IPG膠條進(jìn)行電泳。

圖1 不同裂解液溶解OMPs對(duì)雙向電泳圖譜的影響Fig.1The effect of different lysis buffer to 2-DE profile of OMPs

圖2 不同pH范圍對(duì)雙向電泳圖譜的影響Fig.2The effect of different pH range to 2-DE profile of OMPs

2.1.3不同聚焦時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG膠條，上樣量為750μg，IEF程序?yàn)棰蚧颌?，考馬斯亮藍(lán)染色，2-DE圖譜顯示，總聚焦功率由程序Ⅱ200000VHrs增加至程序Ⅲ410000VHrs時(shí)，蛋白質(zhì)充分聚焦，凝膠圖上的蛋白質(zhì)點(diǎn)呈圓點(diǎn)，無(wú)橫向拖尾(圖 3)。

2.1.4不同上樣量對(duì)蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG膠條，IEF程序?yàn)棰?，考馬斯亮藍(lán)染色，上量樣分別為650μg、750μg、950μg。圖像經(jīng)軟件分析顯示，650μg上樣量有154個(gè)蛋白點(diǎn)(圖4A)，750μg蛋白上樣量有196個(gè)蛋白點(diǎn)(圖3B)，950μg上樣量有163個(gè)蛋白點(diǎn)(圖4B)。

2.1.5不同染色方法對(duì)蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG膠條，上量樣為75μg，IEF程序?yàn)棰?，銀染結(jié)果顯示能夠獲得更多的低豐度蛋白點(diǎn)(圖5)。

圖3 不同聚焦時(shí)間對(duì)雙向電泳圖譜的影響Fig.3The effect of different IEF condition to 2-DE profile of OMPs

圖4 不同上樣量對(duì)雙向電泳圖譜的影響Fig.4The effect of different sample loading to 2-DE profile of OMPs

圖5 銀染獲得的雙向電泳圖譜Fig.5The 2-DE profile of OMPs stained w ith silver

2.1.6樣品的穩(wěn)定性按照優(yōu)化的2-DE條件，分別在第1d、第14d及60d進(jìn)行電泳，圖像經(jīng)Imagemaster 2D Platinum 7.0分析軟件分析，顯示該樣品蛋白點(diǎn)有所減少，第1d時(shí)蛋白點(diǎn)為196個(gè)，第14d蛋白點(diǎn)189個(gè)，第60d時(shí)蛋白點(diǎn)為146個(gè)，表明應(yīng)盡量采用新鮮制備的蛋白樣品，才能使樣品更真實(shí)地反應(yīng)細(xì)菌本身蛋白表達(dá)情況。

2.22 -DE圖譜 最終我們確定了采用碳酸鈉法提取Bb的OMPs，裂解液Ⅰ溶解蛋白樣品，pH4～7的13cm線(xiàn)性膠條考染上樣量為750μg，銀染量為75μg，主動(dòng)水化方式、聚焦總電壓時(shí)間積為41000Vhrs時(shí)能夠得到聚焦良好、分離清晰的Bb的OMPs圖譜。并能夠獲得比較多的蛋白斑點(diǎn)(190±5)個(gè)(圖 5)；2-DE圖譜顯示，Bb的OMsP等電點(diǎn)分布范圍約在pI 4～7之間，蛋白斑點(diǎn)大部分在偏弱酸性區(qū)域(pH4.5～6)；蛋白質(zhì)的分子量分布范圍基本在從10ku～100ku之間，主要集中在30ku～75ku之間。

3 討 論

2-DE的關(guān)鍵在于蛋白樣品的制備，因此蛋白質(zhì)提取方法為影響2-DE結(jié)果的重要因素。OMPs的提取方法很多，常用的有等密度梯度離心法[8]，Sarkosyl法[9]、Wooldridge 法[10]、碳酸鈉法[11]等。這幾種方法中，等密度梯度離心耗時(shí)較長(zhǎng)，Sarkosyl法所需試劑昂貴，Wooldridge法提取蛋白，經(jīng)兩次離心后，蛋白沉淀很難溶解；商品化的試劑盒操作簡(jiǎn)便，體積小，節(jié)約時(shí)間，但獲得的樣品量少，需要多次制備樣品，提取的蛋白含有一定疏水結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)比較，本研究選擇了碳酸鈉法提取OMPs，其原理是，OMPs在堿性的碳酸鈉環(huán)境中，由閉合的微囊泡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放的片層結(jié)構(gòu)，同時(shí)剝離松散連接的外周蛋白[4]，該方法重復(fù)性好，能保留完整的OMPs，其提取的OMPs比例較高。

OMPs是革蘭氏陰性細(xì)菌的特有成分，含有豐富的疏水性結(jié)構(gòu)，水溶性差，含量低，不利于OMPs的2-DE分離。Molloy等研究顯示，采用不同的裂解液對(duì)E.coli蛋白進(jìn)行分級(jí)提取獲得2-DE圖譜與一步法用5M Urea、2M Thiourea、2%(W/V)CHAPS、2%(W/V)SB3～10裂解液溶解獲取的圖譜進(jìn)行匹配，能夠獲得與分級(jí)提取基本相同的蛋白[4]。通過(guò)比較，本研究最終選擇采用該裂解液溶解OMPs，溶解效果良好。

上樣量的大小與膠條長(zhǎng)度、pH范圍及染色方法等有關(guān)，是影響2-DE圖譜效果的另一重要因素。上樣量低，易造成蛋白斑點(diǎn)模糊不清或無(wú)法顯示；上樣量提高利于低豐度蛋白的檢測(cè)，但高豐度蛋白斑點(diǎn)過(guò)大，會(huì)影響其他蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離；染色方法的靈敏度高，所需蛋白上樣量可適當(dāng)減少。通過(guò)比較，我們最終選擇13cm pH4～7IPG膠條的上樣量為750μg，銀染上樣量為75μg，獲得了蛋白點(diǎn)清晰聚集良好的蛋白圖譜。

本研究首次應(yīng)用2-DE技術(shù)分離Bb的OMPs，通過(guò)對(duì)裂解液、上樣量、聚焦條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了分辨率高、重復(fù)性好的Bb OMPs的2-DE圖譜，為進(jìn)一步研究Bb的OMPs免疫蛋白質(zhì)組學(xué)提供了技術(shù)保障。

[1]Llombart M,Chiner E,Senent C.Necrotizing Pneumonia due to Bordetella bronchiseptica in an immunocompetent woman[J].Arch Bronconeumol,2006,42:255-256.

[2]Osborn M J.Structure and biosynthesis of the bacterial cell wall[J].Annu Rev Biochem,1969,38:501-538.

[3]趙香汝，楊漢春.細(xì)菌外膜蛋白的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1997，23：41-42.

[4]Molloy M P,Herbert B R.Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis[J].Electrophoresis,1998,19:837-844.

[5]Molloy M P,Herbert B R,Slade M B,et al.Proteom ic analysis of the Escherichia coli outer membrane[J].Eur J Biochem,2000,267:2871-2881.

[6]Liao Yong-hong,Deng Jun-hua,Zhang An-ding,et al.Immunoproteom ic analysis of outer membrane proteins and extracellular proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae JL03serotype 3[J].BMC M icrobiol,2009,9:172-179.

[7]Neuhoff V,Arold N.Improved staining of proteins in polyacrylam ide gels including isoelectric focusing gels w ith clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-25-and R-250[J].Electrophoresis,1988,9:255-262.

[8]Osborn M J,Gander JE,Parisi E,et al.Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium.Isolation and characterization of cytoplasm ic and outer membrane[J].J Biol Chem,1972,247:3962-3972.

[9]Filip C,Fletcher G,Wulff J L,et al.Solubilization of the cytoplasmic membrane of Escheri-chia coli by the ionic detergent sodium-lauryl sarcosinate[J].JBacteriol,1973,115:717-722.

[10]Roberts M,Wooldridge K G,Gavine H,et al.Inhibition of biological activities of the aerobactin receptor protein in rough strains of Escherichia coli by polyclonal antiserum raised against native protein[J].JGen M icrobiol,1989,135:2387-2398.

[11]Fujiki Y,Hubbard A L,Fow ler S,et al.Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment:application to endoplasm ic reticulum[J].JCell Biol，1982,93:97-102.