楊婧娟，于海寧，林秋生，沈生榮*

1浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058;2浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014

三七是五加科人參屬植物，拉丁學(xué)名為Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，是傳統(tǒng)的名貴中藥材。三七根中主要的有效成分是達(dá)瑪烷型人參皂苷 Rb1、Rg1、Rd、Re和三七特有皂苷R1，以及少量的人參皂苷Rg2、Rh1等20多種皂苷成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［1］，三七總皂苷和其中的部分單體皂苷在血液、心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等方面均有較好的活性。

但是，天然人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)并不是活性最佳狀態(tài)，其生物活性依賴于配基上的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，糖鏈的數(shù)目及其與配基結(jié)合的位置。代謝研究表明，人參皂苷經(jīng)口服后［2］，在體內(nèi)逐級代謝為次級苷，最后代謝為苷元，這些次級苷和苷元作為人參稀有皂苷才是在體內(nèi)真正發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)?？鼓[瘤活性的構(gòu)效關(guān)系研究也表明:低糖鏈的皂苷及苷元具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用［3］。

本研究利用微生物發(fā)酵三七，通過微生物產(chǎn)生豐富酶系協(xié)同作用，破壞三七根組織細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)，使三七皂苷溶出增加，在有效成分暴露后，糖苷酶進(jìn)一步水解部分皂苷配基上的糖鏈，轉(zhuǎn)化成活性更高的低糖鏈稀有皂苷。如此，發(fā)酵提取使有效成分溶出增加，同時，由于生物轉(zhuǎn)化的作用使總皂苷中稀有皂苷成分也相應(yīng)增加，勢必會對三七總皂苷的生物活性造成一定影響。以抗氧化、抑菌活性為指標(biāo)，通過對比發(fā)酵提取與常規(guī)法提取所得三七總皂苷提取物的活性差異，探討發(fā)酵后總皂苷及其組分含量的變化，與活性增強(qiáng)之間的關(guān)系，為微生物發(fā)酵輔助提取法在具生物轉(zhuǎn)化特性的天然產(chǎn)物提取新方法中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七藥材干燥粉碎后過40目篩備用(產(chǎn)自云南文山，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)熊耀康教授鑒定為五加科人參屬植物三七的干燥根);菌種:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)(浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院農(nóng)化所植物營養(yǎng)學(xué)實驗室保藏菌種);金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，S.aureus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus，B.cereus)、大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cereviseae，S.cereviseae)、青霉菌 (Penicillium ，P.sp.)(浙江大學(xué)生工食品學(xué)院發(fā)酵所實驗室保藏菌種)

主要試劑:人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品:人參皂苷 Rg1、Rb1、Re、Rd、Rh1、Rg3、Rh1、F1、三七皂苷 R1(純度98%)，購自南京澤朗醫(yī)藥科技;DPPH、TPTZ、水溶性維生素E(Trolox)購自Sigma，山梨酸鉀、苯甲酸鈉購自Aladdin。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司);數(shù)控?fù)u床(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司);酶標(biāo)儀(MD29SpectraMax 190，F(xiàn)inland);L500臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);日本島津LC-2010A HT高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 三七總皂苷粗提物的制備

干燥三七→粉碎→過40目篩→與輔料麩皮按7∶3比例混勻滅菌→枯草芽孢桿菌35℃固態(tài)發(fā)酵4 d→70%乙醇回流提?。?］1.5 h(固液比 1∶8，80 ℃)→離心取上清，殘渣→70%乙醇回流再提取1.5 h(固液比1∶5，80℃)→離心取上清→合并兩次上清，定容→濃縮成固形物，作為供試發(fā)酵提取樣備用(fermentation-assisted extraction samples，F(xiàn)AES);另取干燥粉碎的三七粉直接進(jìn)行乙醇回流提取，濃縮成固形物作為供試常規(guī)醇提樣(traditional extraction samples，TES);為排除微生物發(fā)酵提取過程中，營養(yǎng)輔料麩皮的加入對活性測定造成干擾，以未接種微生物的三七及輔料混合培養(yǎng)基質(zhì)同操作提取，濃縮得到的固形物作為空白對照樣(control)。

1.3.2 三七總皂苷及其組分單體皂苷含量的測定

1.3.2.1 三七總皂苷的含量測定

三七皂苷的總含量測定按宋宏新等的方法［4］操作，以人參皂苷Rg1為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長545 nm處測定吸光度值。以皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=17.16x-0.1011，R2=0.9987。取各供試樣的乙醇提取液稀釋至一定倍數(shù)，按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定方法操作，按下式計算樣品中三七總皂苷的含量:

式中，n為測量稀釋倍數(shù)，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得濃度(mg/mL)，V1為測定反應(yīng)體系總體積(mL)，V2為測定取用受試樣液體積(mL)，V3為提取定容終體積(mL)，W為三七生藥稱量質(zhì)量(mg)。

1.3.2.2 三七總皂苷中各組分單體皂苷的含量測定

色譜條件:色譜柱:RP18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);進(jìn)樣量:20 μL;流速:1 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:203 nm;流動相:水(A)-乙腈(B)，參照 Aik-Jiang Lau 等［5］方法二元梯度洗脫，0～30 min，20%B;30～60 min，20% ～45%B;60～78 min，45% ～75%B，78 ～80 min，75% ～100%B。

1.3.3 三七總皂苷提取物的抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH 自由基清除法測定抗氧化能力［6］

取不同質(zhì)量濃度的樣液1.5 mL分別加入2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中，避光反應(yīng)20 min，于波長517 nm下測定吸光度值A(chǔ)i;同上測定1.5 mL 50%乙醇加入2.5 mL DPPH溶液反應(yīng)的吸光度AC;測定1.5 mL樣液與2.5 mL 50%乙醇反應(yīng)的吸光度Aj。以Trolox作為參照，實驗重復(fù)3次，計算自由基清除率:清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100%。

各樣品對DPPH自由基的清除能力以其清除率達(dá)到50%時的作用濃度(IC50值)表示。

1.3.3.2 FRAP 法測定抗氧化能力［7］

取稀釋不同濃度的樣液0.1 mL，加入1.9 mL FRAP試劑(0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液及20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的體積比混合)，37℃反應(yīng)10 min，于593 nm處測吸光度值，實驗重復(fù)3次。另以不同濃度的Trolox同法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算三七總皂苷的Trolox當(dāng)量抗氧化能力TEAC。

1.3.3.3 鐵離子還原能力的測定［8］

取不同質(zhì)量濃度的樣液1 mL，分別加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 rpm離心10 min，取上清2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后反應(yīng)10 min，于波長700 nm處測定吸光度，實驗重復(fù)3次。另以不同濃度的Trolox同法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算三七總皂苷的Trolox當(dāng)量抗氧化能力TEAC。

1.3.4 三七總皂苷提取物的抑菌活性研究［9］

1.3.4.1 指示菌懸液制備

將細(xì)菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h、真菌于PDB中28℃培養(yǎng)48 h，霉菌制成孢子懸浮液，所有受試菌均調(diào)節(jié)菌液密度至105～106CFU/mL備用。

1.3.4.2 打孔法測定三七總皂苷的抑菌活性

取100 μL制備好的菌懸液均勻涂布于含15 mL培養(yǎng)基的平板上，并用5 mm打孔器將涂布好菌液的平板打孔，分別加入30 mg/mL過濾除菌后的樣液30 μL，并設(shè)置試劑空白(無菌水)及陽性對照(山梨酸鉀、苯甲酸鈉)，每個樣液做3次平行。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，真菌于28℃恒溫培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中抑菌圈直徑。

1.3.4.3 最低抑菌濃度的測定(MIC)

取過濾除菌后的受試樣液1 mL加入溶化至55℃左右的9 mL瓊脂培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)控制樣液在培養(yǎng)基中的終濃度為 1、3、5、10、15、20 mg/mL，待培養(yǎng)基凝固后，加入30 μL制備好的菌懸液并涂布均勻。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，真菌于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落被完全抑制的最低樣液質(zhì)量濃度即為最低抑菌濃度MIC(mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三七總皂苷及其組分皂苷含量測定結(jié)果

不同提取方式所得三七總皂苷及其各組分人參皂苷的含量測定結(jié)果見下表1。

表1 不同提取方式所得三七總皂苷及其組分的含量Table 1 Concentrations of total Panax notoginseng saponins and ginsenosides component extracted by different methods

發(fā)酵提取得到的三七總皂苷含量為12.25±0.21%，相比未經(jīng)發(fā)酵的常規(guī)醇提含量(9.05±0.43%)，提高了 35.36%，單體成分 Rb1、Rd 等的溶出明顯增加，說明微生物發(fā)酵法能有效破壞植物組織細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，利于有效成分溶出。另外，發(fā)酵提取的三七皂苷中，Rh1含量明顯增多，還出現(xiàn)了常規(guī)醇提中未有的人參皂苷F1，而Rg1、Re、三七皂苷R1組分的含量卻相對減少，推測低糖鏈Rh1及F1含量的增加有可能是部分Rg1、Re、R1在微生物酶作用下，其皂苷元糖鏈上的部分糖基被水解，發(fā)生了組分間的轉(zhuǎn)化所致?？瞻讓φ蘸肯啾瘸Ｒ?guī)提取略有降低，有可能是滅菌時在一定溫度下，藥材自身含有的酶對皂苷成分發(fā)生了微弱的分解。

2.3 發(fā)酵提取對三七總皂苷提取物抗氧化活性的影響

由圖1及表2中各項抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果可知，三七總皂苷抗氧化能力對比常用的人工合成抗氧化劑Trolox相對弱，但仍顯示一定的自由基清除作用及還原能力，其中發(fā)酵法提取的三七總皂苷抗氧化能力要明顯優(yōu)于常規(guī)醇提的皂苷。圖1對于自由基DPPH的清除率，發(fā)酵提取的三七皂苷IC50值為0.377 mg/mL，與常規(guī)醇提樣的 IC50(1.226 mg/mL)相比顯著性降低，對照組的IC50值(1.014 mg/mL)也略有降低，說明麩皮中可能有溶出物在一定程度有清除DPPH自由基的作用，但對還原力無影響。對Fe3+離子的還原作用，發(fā)酵提取的每克干質(zhì)量三七皂苷固形物中相當(dāng)于Trolox的量，相比常規(guī)醇提法顯著性增大，說明發(fā)酵法提取的三七皂苷對Fe3+離子的還原作用比常規(guī)醇提法強(qiáng)。

圖1 不同提取方式所得三七總皂苷對DPPH自由基清除能力的比較Fig.1 DPPH scavenging capacity of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

表2 不同提取方式所得三七總皂苷的Fe3+還原能力Table 2 Fe3+reduction capability of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

已有的眾多研究結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，活性物質(zhì)的抗氧化能力是隨著濃度的增大而增強(qiáng)。因此，在一定程度上可以解釋發(fā)酵法提取的三七皂苷抗氧化能力優(yōu)于常規(guī)醇提法。另外，發(fā)酵提取的三七皂苷中組分的種類及含量與常規(guī)提取法存在差異。發(fā)酵提取的二醇型皂苷 Rb1、Rd、Rg3含量較高，三醇型皂苷Rg1、Re部分轉(zhuǎn)化為低糖鏈的Rh1、F1，這也有可能導(dǎo)致抗氧化能力發(fā)生變化。研究顯示，糖基與三萜達(dá)瑪烷環(huán)的連接部位和方式的差異可以導(dǎo)致抗氧化活性的不同。Liu［10］等研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷C-3位葡萄糖基的連接形式顯著影響AAPH誘導(dǎo)溶血的抗氧化活性，Rb3和Rc的C-3位兩個葡萄糖分別以1，1-及2，1-醚鍵結(jié)合，由于連接形式的不同，使得Rb3的IC50低于Rc。另外，各種人參皂苷和維生素E的協(xié)同抗氧化活性結(jié)果顯示，各組分單獨使用時并不是有效的抗氧化劑，但是Rh1、Re、R1卻有顯著地協(xié)同抗氧化活性。而在所有人參皂苷中，Rb1和Rb3是最重要的抗氧化組分。這些研究結(jié)果提示我們，經(jīng)發(fā)酵后提取的總皂苷中各組分變化，會引起活性結(jié)構(gòu)及協(xié)同作用間的變化，從而致使三七總皂苷抗氧化能力也隨之發(fā)生改變。此外，也不排除發(fā)酵法提出的成分較復(fù)雜，對抗氧化能力產(chǎn)生了一定的影響。

2.4 發(fā)酵提取對三七總皂苷提取物抑菌活性的影響

表3 不同提取方式所得三七總皂苷對指示菌的抑菌圈直徑Table 3 Diameters of inhibition zone of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods against the indicator bacteria

注:陰性對照(無菌水)抑菌圈均無，“-”表示無抑菌效果。Potassium sorbate:山梨酸鉀;Sodium benzoate:苯甲酸鈉。Note:inhibition zone of negative control(sterile water)cannot detected，“-”indicate no antimicrobial activity.

表4 不同提取方式所得三七總皂苷的最低抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

由表3、4可以看出，發(fā)酵法提取的三七總皂苷對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及酵母菌、青霉菌均有一定的抑制作用，且相比常規(guī)醇提法，抑菌效果更好。如常規(guī)醇提的三七總皂苷在實驗濃度范圍內(nèi)對金黃色葡萄球菌無抑制作用，而濃度為3 mg/mL的發(fā)酵提取物即可完全抑制細(xì)菌生長。但是，兩種方式提取的三七總皂苷在實驗濃度范圍內(nèi)，對大腸桿菌均無抑制作用。

另外，按指示菌分類比較可以看出，三七總皂苷對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌的抑制效果較好，對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)無抑制作用，對酵母和青霉等真菌的抑制效果也稍弱。發(fā)酵法提取的三七皂苷對臘樣芽孢桿菌最低抑制濃度為1 mg/mL，而抑制青霉則達(dá)15 mg/mL。

實驗結(jié)果顯示，發(fā)酵法提取的三七總皂苷抑菌能力比常規(guī)醇提法強(qiáng)。究其原因，一方面可能是抑菌能力隨皂苷含量的增大而增強(qiáng)，因為在相同的固形物濃度下，發(fā)酵法提取的皂苷含量相對較高，所以導(dǎo)致了對菌體抑制作用的增強(qiáng)。另一方面，發(fā)酵提取的皂苷成分變化也可能對抑菌活性造成了影響。在有關(guān)苜蓿皂苷抑菌構(gòu)效關(guān)系的研究中［11］，顯示糖鏈并不是皂苷具有抑菌活性的決定性基團(tuán)，事實上，去糖基的皂苷元反而表現(xiàn)出更高的抑菌活性。另外，有效成分的疏水性也是抑菌活性的關(guān)鍵。香芹酚和百里香酚發(fā)揮抑菌功效的重要特點就是其疏水性，通過破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)部生命物質(zhì)外泄，從而損害菌體酶系統(tǒng)，擾亂菌體正常代謝而造成菌體死亡。在抗菌肽分子結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系中［12］，也顯示在一定條件下，疏水性越大，其抗菌活性也就越強(qiáng)。人參皂苷是兩性分子，達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷元是疏水基團(tuán)，連接的糖鏈增加了其親水性。發(fā)酵過程中，部分人參皂苷Rg1、Re及三七皂苷R1在酶的作用下，皂苷元C-20及C-6位上糖分子被部分水解，轉(zhuǎn)化成了低糖鏈的Rh1及F1，由于皂苷配基上親水性的糖鏈減少，疏水性增強(qiáng)，這兩個組分在發(fā)酵提取的總皂苷中含量又增加，從而對抑菌活性的提高有一定的影響。

3 結(jié)論

應(yīng)用微生物發(fā)酵法提取所得三七總皂苷含量比常規(guī)提取含量提高了35.36%，其中人參二醇型皂苷Rb1、Rd溶出明顯增加，部分三醇型皂苷特異性的轉(zhuǎn)化為稀有皂苷組分Rh1、F1?？傇碥占捌浣M分含量的變化帶來了活性的增強(qiáng)，使發(fā)酵提取的三七總皂苷對DPPH自由基的清除活性提高，對Fe3+離子的還原作用也比常規(guī)提取顯著性增強(qiáng)。對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及酵母菌、青霉菌也顯示出更強(qiáng)的抑制活性。實驗表明應(yīng)用發(fā)酵法輔助提取能使有效成分溶出增加，同時能實現(xiàn)成分間的生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步提高其生物活性，具有重要的實際應(yīng)用價值。

1 Ng TB.Pharmacological activity of sanchi ginseng(Panax notoginseng).J Pharm Pharmacol，2006，58:1007-1019.

2 Tawab MA，Bahr U，Karas M，et al.Degradation of ginsenosides in humans after oral andministration.Drug Metab Dispos，2003，31:1065-1071.

3 Leung KW，Wong AS.Pharmacology of ginsenosides:a literature review.Chin Med，2010，5:20.

4 Song HX(宋宏新)，Liu J(劉靜)，Zhang YJ(張彥娟).Study on semi-bionic zymolysis extraction of Panax notoginseng saponins.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40:905-907.

5 Lau AJ，Seo BH，Woo SO，et al.High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng.J Chromatogr A，2004，1057:141-149.

6 Zheng DY(鄭德勇)，An XN(安鑫南).Determining method of DPPH free radical scavenging activity of bamboo leaf extractives.J Fujian Agri Forest Univ，Nat Sci(福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，自科版)，2005，34:59-62.

7 Xu GH，Liu DH，Chen JC，et al.Juice components and antioxidant capacity of citrus varieties cultivated in China.Food Chem，2008，106:545-551.

8 Apati P，Szentmihalyi K，Kristo ST，et al.Herbal remedies of Solidago-correlation of phytochemical characteristics and antioxidative properties.J Pharm Biomed Anal，2003，32:1045-1053.

9 Tian F，Li B，Ji BP，et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis:The polarity affects the bioactivities.Food Chem，2009，113:173-179.

10 Liu ZQ，Luo XY，Sun YX，et al.Can ginsenosides protect human erythrocytes against free-radical-induced hemolysis?Biochim Biophys Acta，2002，1572:58-66.

11 Avato P，Bucci R，Tava A，et al.Antimicrobial activity of saponins from Medicago sp.:structure-activity relationship.Phytother Res，2006，20:454-457.

12 Li XF(李曉帆).Structure-activity relationship of antimicrobial peptides and its utilization in molecular design.Sci Technol Inform(科技信息)，2011，5:133.