朱曉娜，曹偉偉，李明靜，2*

1河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;2河南省天然藥物與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)封 475004

槐花(Sophora japonica)又名槐蕊，為豆科植物槐的干燥花朵及花蕾，其中主要的黃酮類(lèi)化合物是蘆丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)［1］。研究表明，蘆丁具有抗心肌缺氧、缺血、抗心律失常、降低血清膽固醇、抑制血小板集聚、抗?jié)?、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗輻射、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等功能［2］。槲皮素除了有抗腫瘤、抗血小板聚集和抗氧化的作用外，還具有保護(hù)糖尿病的腎臟、腸粘膜、抗憂郁、抗心胸肥大、降壓等作用［3］。分離制備槐花總黃酮中的活性成分為進(jìn)一步研究黃酮類(lèi)化合物藥效作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的天然藥物具有重要的意義。

目前，槐花的提取分離主要采用重結(jié)晶法和柱色譜法，分離周期長(zhǎng)，消耗溶劑多，操作復(fù)雜。高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC)作為一種新型分離純化技術(shù)，采取液—液分配體系，克服了由固相載體帶來(lái)的樣品損失、失活、變性等缺點(diǎn)，操作方便，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的分離純化［4，5］。許有威［6］等用以乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3，v/v)為溶劑系統(tǒng)，建立了高速逆流色譜分離槐花中蘆丁的方法。此方法簡(jiǎn)便，但是耗時(shí)較長(zhǎng)。離子液體［7］，是一種在室溫下完全由離子組成的有機(jī)液體物質(zhì)，作為一種環(huán)境友好的溶劑，可取代揮發(fā)性溶劑，被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、有機(jī)合成、生物化學(xué)以及分離等領(lǐng)域［8］。但離子液體應(yīng)用于逆流色譜的報(bào)道很少。本文采用超聲提取從槐花中得到粗提物，再經(jīng)HSCCC進(jìn)一步分離得到蘆丁和槲皮素(純度都高于97%)。同時(shí)以離子液體作為高速逆流色譜流動(dòng)相添加劑，縮短了出峰時(shí)間，提高了分離度，達(dá)到理想的分離效果，為槐花黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提高了一種快速實(shí)用的新方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A型高速逆流色譜儀(中國(guó)上海同田生化技術(shù)有限公司);AKTA purifier泵及紫外檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)GE公司);Agilent 1100 HPLC儀(美國(guó)Agilent公司);超聲波清洗器(上海現(xiàn)科儀器有限公司);DZF-6000型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);冷凍干燥機(jī)(Martin Christ Alphal-2，German)。

1.2 試劑

氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、冰醋酸等均為分析純，高效液相色譜所用的甲醇為色譜純，均為天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;水為二次蒸餾水;［BMIM］［PF6］:1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸購(gòu)于上海成捷化學(xué)有限公司。

1.3 材料

槐花購(gòu)于開(kāi)封市中醫(yī)院，40℃烘干，粉碎，用60%乙醇溶液，料液比1∶15(g/v)超聲提取30 min，提取3次，合并濾液，減壓濃縮至醇干［9］，放置沉淀24 h，離心沉淀，冷凍干燥，得槐花總黃酮粗提物(總黃酮純度約為60%)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶劑體系及樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)兩相溶劑體系，充分震搖后在室溫下靜置12 h。使用前將上相和下相分離，超聲脫氣30 min，冷卻、待用。稱(chēng)取50 mg槐花總黃酮粗提物，用溶劑體系的上下相各4 mL超聲溶解，備用。

2.2 高速逆流色譜法分離制備

開(kāi)啟恒溫循環(huán)器，設(shè)定溫度為25℃。以10 mL/min的流速將上相泵入主機(jī)，當(dāng)固定相充滿主機(jī)管道后，改用2 mL/min的流速泵入下相，同時(shí)啟動(dòng)主機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為800 rpm。待流動(dòng)相流出約20 mL后，說(shuō)明體系已達(dá)平衡。開(kāi)啟AKTA purifier檢測(cè)系統(tǒng)，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)，待基線穩(wěn)定后，將樣品溶液注入主機(jī)。流出物在256 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，收集目標(biāo)成分，經(jīng)真空干燥箱干燥后，稱(chēng)重，然后經(jīng)高效液相鑒定純度。

2.3 高效液相色譜分析條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶0.02%-磷酸水溶液(50∶50，v/v);檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為 15 μL;流速為 0.03 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶劑體系選擇

溶劑體系的選擇在高速逆流色譜分離中至關(guān)重要。根據(jù)色譜理論，利用高速逆流色譜進(jìn)行樣品分離時(shí)，樣品在互不相溶的兩相中的分配系數(shù)在0.5-2之間，兩相溶劑體系分層時(shí)間小于30 s［10］。本文采用TLC、HPLC測(cè)定。

3.1.1 薄層色譜法(TLC)

選取乙酸乙酯∶氯仿∶甲醇∶水;氯仿∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水四個(gè)體系。分別配制不同比例的上述四個(gè)體系，取上下相各5 mL，加入5 mg槐花總黃酮粗提物，超聲溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置分層，取等量的上、下相薄層展開(kāi)，根據(jù)展開(kāi)劑乙酸乙酯∶水∶冰醋酸(8∶1∶1，v/v)展開(kāi)后，斑點(diǎn)的位置、大小、顏色的深淺粗略判斷目標(biāo)產(chǎn)物在上、下相中的分配情況。

TLC結(jié)果表明:溶劑體系為氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)時(shí)，目標(biāo)化合物在溶劑體系的上下相中溶解程度相近。通過(guò)薄層色譜對(duì)溶劑體系的初步篩選確定氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)為分離體系。

3.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

稱(chēng)取5 mg槐花黃酮粗提物溶于事先平衡好的兩相溶劑(上、下相各5 mL)，超聲使樣品充分溶解，靜置平衡，取上下相各3 mL，蒸干，用色譜級(jí)甲醇溶解，經(jīng)HPLC檢測(cè)，并計(jì)算出各目標(biāo)化合物的分配系數(shù)(K=Aupper/Alower，A為目標(biāo)峰面積)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，樣品在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)溶劑體系中的分配系數(shù)在0.5 ～2 范圍內(nèi)，通過(guò)HSCCC預(yù)分離后，化合物之間可以分離，但分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)體系中加入一定比例的冰醋酸和離子液體，可以改善分離效果。當(dāng)利用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)體系，并加入1‰的1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸(［BMIM］［PF6］)分離時(shí)，化合物分離效果較好，分離時(shí)間適中。這可能是由于所分離黃酮類(lèi)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在體系中加入少量的酸，讓目標(biāo)樣品不電離增加有機(jī)性，從而可以改善分離效果［11］。離子液體可吸附在固定相表面，可抑制流動(dòng)相的分配，從而完善峰形［12］。因此，確定正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)為最終使用體系，并在1000 mL上述溶劑體系中，加入1 mL［BMIM］［PF6］為流動(dòng)相添加劑。

表1 2種黃酮類(lèi)化合物在三種溶劑體系中的分配系數(shù)(K)Table 1 The K(Partition coefficients)values of 2 flavones in three solvent systems

3.2 高速逆流分離制備的結(jié)果

按2.2操作方法經(jīng)高速逆流色譜從槐花粗提物中分離制備得到3個(gè)流分(見(jiàn)圖1和圖2中 a、b、c)。結(jié)果顯示，從50 mg槐花總黃酮粗提物中一次分離得到流分 a(18.2 mg)、流分 b(9.6 mg)、流分c(5.4 mg)。

圖1 不加離子液體、(B)加入［BMIM］［PF6］槐花粗提物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatograms of crude extract of Sophora japonica without ionic liquid(A)and with［BMIM］［PF6］(B)

由圖1(A＆B)可以看出，在兩相溶劑體系中，加入1‰離子液體［BMIM］［PF6］，分離效果得到明顯改善。出峰時(shí)間由85 min提前為55 min，分離度由0.9提高到1.8，已經(jīng)達(dá)到完全分離。其作用機(jī)理可能是:咪唑類(lèi)陽(yáng)離子和目標(biāo)化合物之間的H鍵起著重要作用;PF-6的電負(fù)性使得化合物出峰時(shí)間縮短;部分離子液體附著與固定相表面，抑制其他成分在流動(dòng)相的分配，完善峰形［13］。

圖2 (A)槐花黃酮粗提物、(B)純化出的化合物a(蘆丁)、(C)純化出的化合物b(槲皮素)、(D)未知混合物峰的高效液相圖Fig.2 HPLC chromatograms of(A)crude extract of Sophora japonica，(B)Rutin，(C)Quercetin and(D)Impurities

3.3 純度分析

采用2.3的條件對(duì)高速逆流色譜所得到的流分a、b、c進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，結(jié)果顯示峰a和b分別是蘆丁和槲皮素，經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算可知純度均大于97%，峰c為未知成分混合峰。結(jié)果如圖2所示。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用高速逆流色譜法首次從槐花粗提物中一步分離制備了蘆丁、槲皮素兩種黃酮類(lèi)化合物，均達(dá)到較好的分離和純化效果，利用HSCCC分離植物粗提物中的活性成分，可一步得到一種或幾種單體，此方法操作簡(jiǎn)便、快速，有其他分離手段不可替代的優(yōu)點(diǎn)。并首次把離子液體作為高速逆流色譜流動(dòng)相添加劑，探討了其對(duì)槐花中蘆丁和槲皮素分離效果的影響，為其他黃酮類(lèi)化合物的分離提供了有益的參考，進(jìn)一步拓展了離子液體在色譜中的應(yīng)用。

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