楊 紅，陳成水

Toll樣受體4參與介導(dǎo)黃曲霉毒素G1對(duì)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的致?lián)p傷作用

楊 紅，陳成水

目的 在基因水平上探討Toll樣受體4（TLR4）參與介導(dǎo)黃曲霉毒素G1（AFG1）對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的致?lián)p傷生物學(xué)效應(yīng)，及其作用機(jī)制和途徑。方法 分離、純化、培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞并配置3個(gè)不同濃度的AFG1液體。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常組、實(shí)驗(yàn)組、溶劑對(duì)照組，每組6個(gè)樣本。正常組加入同等量的無菌生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的AFG1液（高、中、低濃度分組），溶劑對(duì)照組加入同等量的二甲基亞砜（DMSO），終濃度為0.4 ml/ L；同時(shí)處理24 h后在上述5組提取細(xì)胞mRNA，采用RT-PCR法檢測各組TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 正常組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)量較低。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)AFG1液作用后，各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)量顯著高于正常組（P<0.05）和溶劑對(duì)照組（P<0.05），且呈濃度依賴性增高。溶劑對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比，無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論TLR4→NF-κB→炎癥介質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與AFG1對(duì)AT-Ⅱcells的損傷作用。

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；肺損傷；黃曲霉毒素G1；Toll樣受體4；核因子（NF）-κB

已有研究在整體水平和細(xì)胞水平上證實(shí)了黃曲霉毒素G1（AFG1）對(duì)大鼠肺組織和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AT-IIcells）結(jié)構(gòu)和功能的急性影響和損傷的生物學(xué)效應(yīng)[1]。通過RT-PCR技術(shù)分離培養(yǎng)的AT-Ⅱcells有TLR4mRNA的表達(dá)，受外源性刺激后表達(dá)增強(qiáng)，且呈一定的濃度依賴性[2]。所以，AT-Ⅱcells是AFG1作用于肺組織的靶細(xì)胞，AT-Ⅱcells上有TLR4的表達(dá)。那么，AFG1誘導(dǎo)AT-Ⅱcells損傷的調(diào)控機(jī)制中是否存在TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路的存在，關(guān)于TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與AFG1致AT-IIcells損傷生物學(xué)效應(yīng)的研究，尚未見報(bào)道。所以，基于以上基礎(chǔ)，筆者等在實(shí)驗(yàn)中設(shè)想將原代培養(yǎng)的大鼠AT-IIcells作為研究對(duì)象，通過不同濃度AFG1對(duì)AT-IIcells的刺激，探討TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與AFG1致AT-IIcells損傷生物學(xué)效應(yīng)過程及其具體的途徑。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 清潔級(jí)（SPF）雄性大鼠，體重200～250 g/只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1 mg固體裝AFG1，F(xiàn)ermentek ltd由北京銳鑫農(nóng)科貿(mào)有限公司提供。將大鼠隨機(jī)分為正常組（A組）：AT-Ⅱ cells中加入同AFG1液等體積量的無菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組（B組）：據(jù)AFG1液作用濃度不同，分別為B1組（濃度為0.5 mg/L）、B2組（濃度為1.0 mg/L）和B3組（濃度為2.0 mg/L）。溶劑對(duì)照組（C組）：AT-Ⅱ cells中加入同AFG1液等體積量溶劑二甲基亞砜（DMSO）。每組6個(gè)樣本。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、瓊脂糖購自上海生物工程有限公司，胰酶、兔抗大鼠IgG、DNA酶、DMSO購自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司，Trizol試劑購自大連寶生物工程有限公司，DEPC水購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。梯度PCR擴(kuò)增儀購自德國Thermo Hybaid公司，臺(tái)式超速冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司，水平電泳儀購自北京六一電泳廠，凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海山富科學(xué)儀器有限公司，渦旋振蕩器購自江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，電子天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司，制冰機(jī)購自寧波格蘭特制冷設(shè)備廠，紫光分光光度計(jì)購自美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠AT-Ⅱcells的提取 參照文獻(xiàn)[3]的方法，大鼠麻醉后取肺，并將肺組織置于含DNA酶液約3.5 ml的玻璃培養(yǎng)皿中，5 min中內(nèi)將其剪碎，再加入3 ml培養(yǎng)基終止后倒入離心管，用有鈣鎂緩沖液補(bǔ)足20 ml，于37℃水浴中快速晃動(dòng)8 min，再用100、200目大小篩網(wǎng)過濾2次，過濾液分裝于2支15 ml離心管中，1000 r/min離心8 min，棄上清，沉淀加入3～5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻2 min，再加入3 mlPBS后1000 r/min離心8 min，棄紅色上清，再加入PBS液吹打后1000 r/min離心8 min，棄去上清。收集沉淀細(xì)胞用2 ml DMEM+培養(yǎng)基懸浮，以備純度鑒定和細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過純度、活力鑒定[堿性磷酸酶（AKP）染色[4]、電鏡方法鑒定[5]及超微結(jié)構(gòu)觀察]細(xì)胞，并計(jì)數(shù)后用20%DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（1～2）×109/L，接種于培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)板中，標(biāo)記細(xì)胞名稱、日期等，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后更換為10%DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h給予不同濃度的AFG1處理。

1.3.2 AFG1不同濃度的配置及分組 AFG1常用DMSO作為溶劑來溶解，并且配置完成后其終濃度為0.4 ml/L[6]。本實(shí)驗(yàn)購買的是1 mg固體裝AFG1，故用0.2 mlDMSO來溶解，得到5 g/L用DMSO溶解的AFG1。分別取不等量濃度為5 g/L的AFG1液，加入到不同量的培養(yǎng)基中換算配置出2.0、1.0、0.5 mg/L的AFG1液。實(shí)驗(yàn)組分別加入AFG1 0.5、1.0和2.0 mg/L（DMSO終濃度為0.4 ml/L），溶劑對(duì)照組和正常組分別加入DMSO 0.4 ml/L和生理鹽水。24 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3.3 各組有關(guān)指標(biāo)的檢測 本實(shí)驗(yàn)測定的指標(biāo)是正常組、實(shí)驗(yàn)組和溶劑對(duì)照組AT-II cells的TLR 4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表達(dá)及其表達(dá)水平的變化。采用RT-PCR法檢測，即采用Trizol試劑提取各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以待測定的各指標(biāo)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)成像，用Quantity One分析軟件進(jìn)行凝膠掃描分析，以目的基因/β-actin為該基因表達(dá)的相對(duì)值。檢測各組TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)水平及其變化。

2 結(jié) 果

正常組AT-Ⅱ cells上TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)量較低；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)AFG1液作用后，各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)量顯著高于正常組（P<0.05）和溶劑對(duì)照組（P<0.05）,且呈濃度依賴性增高。溶劑對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比，無明顯差異（P>0.05）。各組大鼠AT-Ⅱ cells的TLR4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)量見表1；各組大鼠AT-Ⅱcells的 TLR4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達(dá)的電泳圖，見圖1～4。

表1 各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

與A組相比，P<0.05；與C組相比，P<0.05

TLR4mRNA NF-κBmRNA TNF-α mRNA IL-6mRNA 0.319 9±0.018 38 0.493 8±0.018 48 0.383 9±0.010 76 0.568 2±0.011 97 0.463 9±0.024 09*0.665 9±0.013 62*0.419 2±0.005 38*0.910 6±0.010 55*0.564 4±0.018 63*0.825 2±0.018 51*0.490 9±0.005 61*1.043 9±0.024 55*0.635 7±0.018 72*0.884 3±0.017 80*0.534 0±0.009 98*1.108 3±0.017 20*0.399 0±0.019 22 0.507 1±0.008 74 0.393 4±0.009 30 0.607 5±0.018 16**分組 n A6 B1 6 B2 6 B3 6 C6

圖1 TLR4mRNA電泳圖

圖2 NF-κBmRNA電泳圖

圖3 TNF-α mRNA電泳圖

圖4 IL-6mRNA電泳圖

3 討 論

AFG1是生長在食物及飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物，可大量溶解于氯仿、甲醇、二甲基亞砜等中等極性的有機(jī)溶劑中，易被堿或強(qiáng)氧化劑破壞[7]。研究已證實(shí)AFG1對(duì)肺組織和細(xì)胞具有明顯的致?lián)p傷作用，AFG1作用于AT-Ⅱ cells，引起AT-Ⅱ cells結(jié)構(gòu)和功能改變，說明AFG1直接作用對(duì)肺組織及AT-Ⅱ cells具有明顯的毒性[8]。但有關(guān)于霉菌毒素致AT-Ⅱcells損傷的細(xì)胞和分子學(xué)機(jī)制等還不十分清楚。

TLRs被認(rèn)為是目前哺乳動(dòng)物唯一將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，該受體族作為機(jī)體炎性反應(yīng)鏈的啟動(dòng)蛋白。其中發(fā)現(xiàn)最早和功能相對(duì)比較清楚的是TLR4，它是TLR家族的重要成員，可以和許多內(nèi)源性及外源性配體結(jié)合，通過一系列的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)揮防御和免疫調(diào)節(jié)作用。自1998年P(guān)oltorak等[9]發(fā)現(xiàn)了TLR4以來,其作為炎癥跨膜受體在感染性疾病研究領(lǐng)域中已是熱點(diǎn)，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TLRs中的一條重要通路，與細(xì)胞凋亡、炎癥密切相關(guān)。激活TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能介導(dǎo)霉菌毒素作用于不同的靶細(xì)胞而引起的細(xì)胞毒性作用。所以探討TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AFG1處理AT-Ⅱ cells中的激活情況，以及在致細(xì)胞毒性中的作用，可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)AFG1致肺損傷生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制。基于以上理論基礎(chǔ)和之前的設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)給予不同濃度的AFG1作用于原代培養(yǎng)的大鼠AT-Ⅱ cells，通過測定各組細(xì)胞TLR4的表達(dá)量及表達(dá)水平的變化，以證實(shí)TLR4介導(dǎo)了AFG1致?lián)p傷的炎癥反應(yīng)過程，并探討此炎癥反應(yīng)過程的信號(hào)傳導(dǎo)通路。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組TLR4mRNA的表達(dá)水平較正常組和溶劑對(duì)照組明顯升高（P<0.05），且呈濃度依賴性上升，說明AFG1作用于AT-Ⅱ cells可以激活TLR4。

NF-κB存在于肺內(nèi)多種細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。氧化損傷的AT-Ⅱcells內(nèi)也有NF-κB表達(dá),肺炎癥中AT-Ⅱcells釋放的許多炎癥介質(zhì)如IL-8、IL-6、GM-CSF和TGF-β等都受NF-κB活化調(diào)控，與肺部炎癥密切相關(guān)[10]。本文結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同濃度AFG1作用于AT-Ⅱcells后，NF-κBmRNA較正常組和溶劑對(duì)照組明顯升高（P<0.05），并呈濃度依賴性上升，提示在AFG1作用于AT-Ⅱ cells的過程中有NF-κBmRNA表達(dá)的增加。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4活化可激活NF-κB。本實(shí)驗(yàn)通過AFG1作用于AT-Ⅱcells后在基因水平上對(duì)TLR4mRNA和NF-κBmRNA的測定表明AFG1通過TLR4的介導(dǎo),最終導(dǎo)致NF-κB的活化。同時(shí)證明，在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，由NF-κB來調(diào)控的眾多的炎癥介質(zhì)中，TNF-α和IL-6最具典型意義，也是最重要的2種[11]。TNF-α和IL-6是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)將這2種因子作為檢測指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFG1作用后，ATⅡcells的TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達(dá)量明顯升高,并且隨著AFG1濃度的升高而其表達(dá)量逐漸增高。此結(jié)果表明，AFG1能夠激活A(yù)T-Ⅱcells，并導(dǎo)致TNF-α和IL-6在基因水平上的明顯增高。根據(jù)已知TLR4的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果筆者推測，在AFG1損傷AT-Ⅱcells的過程中，AFG1是通過其膜上的TLR4介導(dǎo)，激活NF-κB，進(jìn)而促使TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達(dá)增高的途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)AT-Ⅱcells的刺激作用的，即這一反應(yīng)過程是通過TLR4→NF-κB→炎癥介質(zhì)這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。

目前還有研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量AFG1作用于AT-Ⅱcells也可以激活JNK蛋白激酶，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，進(jìn)而激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，部分參與介導(dǎo)AFG1致AT-Ⅱ細(xì)胞毒性作用[12]。因此，在AFG1致AT-Ⅱcells損傷的作用機(jī)制中有多少信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，哪條通路占有主導(dǎo)地位，還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，在TLR4的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中，除依賴髓樣分化蛋白MyD88可將TLR4的激活和NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)連接起來外，MyD88銜接蛋白則是一條TLR4非MyD88依賴的通路，在AFG1刺激AT-Ⅱcells的過程中，TLR4是具體通過怎樣的途徑來激活NF-κB，其具體機(jī)制也需進(jìn)一步的研究。另外本實(shí)驗(yàn)只是從基因水平上證實(shí)AFG1對(duì)AT-Ⅱcells的致炎作用機(jī)制中有TLR4介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的存在，至于該通路接下來的蛋白表達(dá)是否具有免疫作用，要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來說明。同時(shí)如何進(jìn)一步深入研究其詳細(xì)的機(jī)制，利用該通路中的信號(hào)受體作為靶位，對(duì)AFG1所致的肺部炎癥進(jìn)行調(diào)控是需要進(jìn)一步探討的問題。

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[2012-04-09收稿，2012-05-10修回]

[本文編輯：韓仲琪 王慶法]

Toll-like receptor 4 mediated inducing-injury role of aflatoxin G1 on rat TypeⅡ alveolar epithelial

YANG Hong①,CHEN Cheng-shui.①Dept.of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital to

cells

Zhejiang University of TCM and Materia Medica,Hangzhou,Zhejiang 310005,China

ObjectiveOn gene level to explore biological effects of Toll-like receptor 4 mediated the injury role of aflatoxin on alveolar typeⅡ epithelial cells,as well as in this process role mechanisms and pathway.MethodsIn this experiment 3 groups were randomly designed.Group 1(normal group);Group 2(the experimental group),and Group 3(solvent control group),6 samples(i.e isolated, purified and cultured Type Ⅱ alveolar epithelial cells,AT-Ⅱ cells),per group.In normal group an equal volume of sterile saline was added;in experimental group(i.e Group 2)added different concetrations of AFG1 solution(i.e 2.0 mg/L,1.0 mg/L and 0.5 mg/L, as B1,B2,B3subgroups);in solvent control group (i.e Group3)added DMSO;in Group 2 and 3,the end concetration of DMSO was 0.4ml/L.Then,after treatment for 24hs,from above-mentioned 5 group extracting mRNA was taken to detect the levels of TLR4mRNA,NF-κBmRNA,TNF-αmRNA and IL-6mRNA of each group by using RT-PCR.ResultsIn normal group on alveolar TypeⅡ epithelial cells the expression of TLR4 mRNA, NF-κBmRNA,TNF-αmRNA and IL-6mRNA was lower levels.In experimental group cells after AFG1 solution acting,those related indicator expressions were significantly higher than that in normal group (P<0.05)and solvent control group (P<0.05),and a dose dependence increased.Solvent control group,in these related indicator expressions compared with normal control group,had no significant differences(P>0.05).ConclusionTLR4→NF-κB→inflammatory mediators involved in signal transduction pathway of AFG1 inducing injury of AT-Ⅱ cells.

Alveolar TypeⅡepithelial cells；Injury of lungs；Aflatoxin G1；Toll-like receptor 4；Nuclear factor (NF)-κB

book=727,ebook=101

R-33:R655.3

A

310005浙江杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（楊紅）；325000浙江溫州，溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（陳成水）