刁雨輝1，霍美蓉2，呂 霖2，周建平2*

1南京市鼓樓醫(yī)院，南京 210009；2中國藥科大學(xué)藥劑教研室，南京 210009

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是從紅豆杉科紅豆屬（Taxus）植物的樹皮中提取得到的一種四環(huán)二萜類化合物，對卵巢癌、乳腺癌、頭頸部癌、非小細(xì)胞性肺癌及前列腺癌療效顯著[1]。由于紫杉醇在水中溶解度極低（＜1 μg·mL-1），口服幾乎不吸收，目前臨床用制劑，如Taxol誖（美國Bristol Myers Squibb公司）、Anzatax誖（澳大利亞Faulding公司）以及國產(chǎn)的紫素誖、泰素誖等，均以聚氧乙烯蓖麻油-無水乙醇（50∶50，v/v）作為紫杉醇復(fù)合溶媒，臨用前生理鹽水或5%葡萄糖注射液稀釋至0.3～1.2 g·L-1靜脈注射。該制劑存在諸多缺陷，如藥物由于溶劑轉(zhuǎn)換析出、處方中的Cremophor EL引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)及對組織毒性等[2]。因此，研究不含Cremophor EL并能提高紫杉醇生物利用度的其它液體制劑成為當(dāng)前的熱點[3-4]。脂質(zhì)體作為一種新型納米藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，能改變其體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為，降低不良反應(yīng)和提高療效，已被用于抗腫瘤藥物制劑的開發(fā)[5]。但由于脂質(zhì)體混懸液在貯存期間易發(fā)生聚集、融合、藥物滲漏及天然磷脂易氧化、水解問題，難以滿足藥物制劑穩(wěn)定性的要求。因此，本課題組嘗試將前體脂質(zhì)體技術(shù)和高分子材料包覆修飾技術(shù)相結(jié)合以解決這一難題。

殼聚糖（Chitosan）是甲殼質(zhì)（Chitin）脫乙?；漠a(chǎn)物，作為自然界唯一大量存在的高分子堿性氨基多糖，與合成高分子材料相比，其具有來源廣泛、價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、無刺激、無致敏、無致突變、良好的生物相容性和生物可降解性、低免疫原性和生物活性等優(yōu)點[6]。殼聚糖分子鏈上帶有大量活性氨基和羥基，易于化學(xué)修飾。近年來，國內(nèi)外已有將殼聚糖通過電荷吸附于脂質(zhì)體表面作為包衣材料的報道[7-9]。本文設(shè)計開發(fā)一類新型的兩親性殼聚糖衍生物 N-辛基-N，O-羧甲基殼聚糖（N-octyl-N，O-carboxymethyl chitosan，OCC）包覆修飾脂質(zhì)體，其中，疏水烷基鏈通過疏水作用可插入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層，增加了多糖包覆修飾的穩(wěn)定性；而羧甲基殼聚糖親水鏈則游離于脂質(zhì)體表面可顯著增加脂質(zhì)體的親水性，并可減少藥物的泄露。本文將系統(tǒng)評價OCC包覆修飾紫杉醇脂質(zhì)體的理化性質(zhì)及體外釋藥行為。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010C高效液相色譜儀（日本島津公司）；Nano-ZS90粒徑儀、Nano-ZS90粒徑儀（英國Malvern公司）；Hitachi JEM-2100透射電子顯微鏡（日本）；Netzsch DSC 204差熱掃描分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司）；ZRS-8G智能溶出儀（天津大學(xué)儀器廠）；電子天平（德國Sartorius電子分析天平有限公司，分度值0.01 mg）。1.2 藥品與試劑

PTX（重慶美聯(lián)制藥有限公司）；大豆磷脂（注射級，上海太偉制藥）；N-辛基-N，O-羧甲基殼聚糖（OCC，本實驗室合成，殼聚糖分子量20 kDa，脫乙酰度90%，辛基取代度10.3%，羧甲基取代度121.6%）；透析袋（MWCO 3500，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）；5%葡萄糖注射液（Glu，中國大冢制藥有限公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；人血漿（南京紫竹林血站提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫杉醇脂質(zhì)體的制備

紫杉醇前體脂質(zhì)體按照本課題組授權(quán)專利制備[10]。將紫杉醇、磷脂、聚乙二醇修飾劑按照一定比例溶解于乙醇，即得紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液。臨用前，將適量紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液緩慢滴入5%葡萄糖溶液中振搖3 min，即得紫杉醇脂質(zhì)體混懸液PTX-LP。

2.2 OCC包覆紫杉醇脂質(zhì)體的制備

將適量紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液緩慢滴入不同濃度（0.1%、0.2%和0.5%）的OCC 5%葡萄糖溶液，振搖10 min，使OCC充分包裹脂質(zhì)體，制得多糖包覆脂質(zhì)體混懸液PTX-LP-OCC。

2.3 HPLC分析[11]

采用RP-HPLC法測定紫杉醇含量。色譜條件∶色譜柱為 Lichrospher C18（416 mm ×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（75∶25）；流速為 1 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為227 nm。

2.4 包封率、粒徑及表面電荷的測定

由于紫杉醇在水介質(zhì)中溶解度非常低，因此水介質(zhì)中的游離藥物和載入脂質(zhì)體中的藥物量相比可以忽略不計。本文采用以下方法測定PTX包封率:PTX-LP和PTX-LP-OCC混懸液以0.8 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液 50 μL，甲醇稀釋定容，按“2.3”項下HPLC方法測定續(xù)濾液中藥物含量。包封率按下列公式計算:

分別取PTX-LP和PTX-LP-OCC脂質(zhì)體混懸液適量，以動態(tài)光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS）測定粒徑大小、分布及Zeta電位。

PTX-LP和PTX-LP-OCC包封率、粒徑及Zeta電位結(jié)果如表1所示。脂質(zhì)體對紫杉醇具有優(yōu)越的包封效果，包封率達(dá)到89.5%，粒徑為236.5 nm；不同量OCC包裹脂質(zhì)體后，紫杉醇包封率沒有明顯的變化（P＞0.05），但是粒徑及表面電荷隨著OCC修飾量的增加顯著增加。當(dāng)修飾量達(dá)到0.5%時，脂質(zhì)體放置一段時間即有明顯藥物沉淀，可能是由于過多烷基鏈插入脂質(zhì)雙層而造成脂質(zhì)體的不穩(wěn)定，因此，后續(xù)研究皆以0.2%為修飾量。

表1 PTX-LP及PTX-LP-OCC理化性質(zhì)（n=3）

2.5 形態(tài)學(xué)觀察

分別取 PTX-LP和 PTX-LP-OCC（0.2%）脂質(zhì)體混懸液適量，滴到專用銅網(wǎng)上，用濾紙小片吸去殘余液體，干燥后用日立JEM-2100透射電鏡觀察形態(tài)，如圖1所示。PTX-LP及PTX-LP-OCC（0.2%）皆呈規(guī)整球形，粒徑分布均勻，與PTX-LP相比，PTX-LP-OCC的粒徑明顯增大，并可觀察到OCC包覆在紫杉醇脂質(zhì)體的外層，該結(jié)果進(jìn)一步證實OCC已成功包覆修飾于脂質(zhì)體表面。

2.6 差示掃描熱分析（differential scanning calorimetry，DSC）

圖 1 PTX-LP（A）及 PTX-LP-OCC（B）透射電鏡圖譜

取紫杉醇原料、空白脂質(zhì)體凍干粉、PTX與空白自組裝脂質(zhì)體凍干粉的物理混合物、PTX-LP凍干粉、OCC以及PTX-LP-OCC凍干粉適量，以10℃·min-1的升溫速率加熱，溫度范圍50～350℃，氮氣氛進(jìn)行DSC分析，結(jié)果如圖2所示。紫杉醇熔點在218℃（圖2a），空白脂質(zhì)體熔點在 102.4℃（圖 2b），兩者混合物同時具有兩者特征峰（圖2c），而含藥的脂質(zhì)體不含藥物信號峰（圖2d），表明藥物可能以無定形或者固態(tài)溶液的形式完全被包裹在脂質(zhì)雙分子層之間。PTX-LP-OCC在163.9℃出現(xiàn)OCC的吸熱峰（圖3e，f），而在200～240℃之間未見藥物吸熱峰，表明OCC修飾不會引起藥物從脂質(zhì)體中泄露，而磷脂吸熱峰從100℃左右降至51.1℃，這可能由于OCC與脂質(zhì)體的磷脂雙分子層發(fā)生了較強的相互作用所致。

圖2 紫杉醇原料（a）、空白脂質(zhì)體凍干粉（b）、紫杉醇原料和空白脂質(zhì)體凍干粉物理混合物（c）、PTX-LP凍干粉（d）、OCC（e）及PTX-LP-OCC凍干粉（f）差示掃描熱分析圖譜

2.7 穩(wěn)定性考察

2.7.1 稀釋穩(wěn)定性 取適量的紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液分別注入5%Glu和0.2%OCC中形成PTXLP 及 PTX-LP-OCC（0.2%），藥物終濃度為 0.7 mg·mL-1，于 0、1、2、4、6、8 h 測定粒徑大小，以不同時間點的粒徑大小及脂質(zhì)體中藥物含量變化對時間作圖，評價兩制劑的稀釋穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。在考察時間內(nèi)，PTX-LP及 PTX-LP-OCC（0.2%）粒徑及藥物含量都沒有明顯變化。

圖3PTX-LP及PTX-LP-OCC稀釋穩(wěn)定性

2.7.2 血漿中穩(wěn)定性 取適量的紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液分別注入5%Glu和0.2%OCC中形成PTX-LP及 PTX-LP-OCC（0.2%），取 0.5 mL與等體積人血漿混合后于37℃孵育，不同時間點離心（3000 r·min-1，5 min），取上清液 50 μL 用甲醇定容，10000 r·min-1離心10 min，測得藥量為Mt，另取0時間點上述樣品，按同法操作測得藥量為M0，以（M0-Mt）與M0的比值評價血漿中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。PTX-LP-OCC（0.2%）在血漿中具有更好的穩(wěn)定性，藥物泄露速度明顯緩于PTX-LP，PTXLP在24 h及48 h藥物泄露了57.2%及60.2%，而PTX-LP-OCC藥物僅泄露了36.5%及44.2%。

2.8 體外釋藥動力學(xué)

圖4 PTX-LP及PTX-LP-OCC血漿中穩(wěn)定性（n=3）

采用全體液平衡反向透析法考察PTX-LP及PTX-LP-OCC（0.2%）的體外釋放動力學(xué)[12-13]。具體方法為:將0.2 mL紫杉醇前體脂質(zhì)體溶液分別用5%1 mL Glu和0.2%OCC 1 mL稀釋，分別取1 mL上述脂質(zhì)體溶液加入400 mL溶出介質(zhì)中（pH 7.4磷酸鹽緩沖液），將透析袋內(nèi)置2 mL溶出介質(zhì)（透析袋提前在釋放介質(zhì)中飽和12 h），并固定于攪拌槳上，37℃水浴攪拌。取0 h透析袋外溶出介質(zhì)溶液 1 mL，甲醇定容至 5 mL，10000 r·min-1離心 10 min后，取上清液進(jìn)HPLC色譜儀，所得峰面積記為A0。在 2、3、4、6、8、12、24 h 分別取透析袋內(nèi)溶液0.1 mL，同時補充0.1 mL溶出介質(zhì)。將樣品溶液與0.4 mL甲醇混合后 10000 r·min-1離心 10 min，取上清液進(jìn)HPLC色譜儀，色譜條件如“2.3”項所述。所得峰面積記為An，各時間點的釋放度通過An/A0×100%計算，每個樣品平行操作6份，以釋放度的平均值對時間繪制釋放度曲線，結(jié)果如圖5所示。PTX-LP-OCC（0.2%）比PTX-LP具有更為緩慢的釋放速度，PTX-LP 4 h及 24 h分別釋放 78.2%及97.2%，而 PTX-LP-OCC（0.2%）4 h及 24 h分別釋放19.4%及79.3%。

3 討 論

圖5 PTX-LP及PTX-LP-OCC體外累計釋放曲線（n=6）

3.1 本文成功制備了兩親性殼聚糖衍生物OCC包覆修飾紫杉醇脂質(zhì)體。紫杉醇脂質(zhì)體系采用前體脂質(zhì)體技術(shù)制備，即將PTX、磷脂、聚乙二醇修飾劑按照一定比例溶解于乙醇，臨用前以5%Glu溶液復(fù)溶，可實現(xiàn)脂質(zhì)體對紫杉醇的良好包載（包封率接近90%），DSC結(jié)果證實藥物以無定形形式存在于脂質(zhì)體內(nèi)部。將多糖衍生物OCC溶于5%葡萄糖，配成不同濃度溶液復(fù)溶前體脂質(zhì)體，即可制得多糖包覆修飾的脂質(zhì)體，結(jié)果表明OCC對脂質(zhì)體包覆修飾對藥物的包封并無顯著影響（P＞0.05），但粒徑和表面負(fù)電荷顯著增加（P＜0.05），說明帶負(fù)電荷的羧甲基殼聚糖成功覆蓋于脂質(zhì)體表面。透射電鏡及DSC結(jié)果亦進(jìn)一步證實了OCC和脂質(zhì)體之間存在較強的相互作用，多糖已成功包覆修飾于脂質(zhì)體外周。

3.2 OCC對脂質(zhì)體的修飾系通過OCC疏水烷基鏈插入到脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層實現(xiàn)，然而疏水烷基鏈的插入有可能造成脂質(zhì)雙層不穩(wěn)定性增加，從而導(dǎo)致載體不穩(wěn)定或藥物泄露。因此本文以PTX-LP為對照，考察了PTX-LP-OCC（0.2%）的稀釋穩(wěn)定性以及血漿中穩(wěn)定性。鑒于PTX臨床靜脈滴注濃度為0.3～1.1 mg·mL-1，滴注時間一般小于 8 h，因此，本文將無多糖修飾脂質(zhì)體以及有多糖修飾脂質(zhì)體分別稀釋至0.7 mg·mL-1，并考察兩者在8 h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，兩者粒徑和含藥量皆并無顯著改變，說明OCC的包覆修飾并不影響脂質(zhì)體的稀釋穩(wěn)定性，且在靜脈滴注時間內(nèi)保持穩(wěn)定。將兩種脂質(zhì)體和血漿孵育，PTX-LP-OCC（0.2%）在血漿中藥物泄露速度明顯緩于PTX-LP，表明 PTX-LP-OCC（0.2%）在體內(nèi)更穩(wěn)定，這可能是由于兩親性多糖衍生物包覆脂質(zhì)體而起到良好的保護(hù)作用，從而減少了藥物在血漿中的泄露。

3.3 納米溶液的體外釋放實驗常采用正相透析法。由于納米載體裝于透析袋中難以與釋放介質(zhì)充分接觸，與靜脈給藥的臨床方式存在一定差異，因此本文以PTX-LP為對照，采用全體液平衡反向透析法評價了PTX-LP-OCC（0.2%）的體外釋放行為，更好的模擬了生理環(huán)境，所得的釋放動力學(xué)參數(shù)更接近體內(nèi)的真實情況。從圖5可看出，PTX-LP在釋放初期存在明顯的突釋現(xiàn)象，4 h藥物釋放量即高達(dá)78.2%，其藥物突釋可能是由于脂溶性的藥物主要存在于脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層間，而脂質(zhì)雙分子層具有流動性，從而造成藥物的快速釋放，過高的突釋效應(yīng)為安全用藥帶來了隱患；而PTX-LP-OCC突釋現(xiàn)象顯著改善，前4 h釋放量僅為19.4%，釋放也更為緩慢，24 h僅釋放79.3%，這可能一方面由于有多糖對脂質(zhì)體的包覆修飾，對脂質(zhì)體有一定的保護(hù)作用，另一方面增加了藥物從脂質(zhì)體擴散釋放出來的難度。PTX-LP-OCC更加平緩的釋藥曲線有助于提高用藥的安全性和維持有效血藥濃度時間。

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