王金，蔡謹(jǐn)，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州，310027)

以木薯渣水解液為碳源固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝的研究*

王金，蔡謹(jǐn)，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州，310027)

利用廉價(jià)的非糧原料及采用新型高效的固定化發(fā)酵技術(shù)對(duì)于實(shí)現(xiàn)丁酸的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。文中研究了纖維床生物反應(yīng)器組成形式對(duì)固定化酪丁酸梭菌產(chǎn)丁酸過程的影響，結(jié)果表明，采用纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)發(fā)酵時(shí)，丁酸終濃度比單柱發(fā)酵提高7.19%，尤其是產(chǎn)率提高了136.7%。以木薯渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)進(jìn)行丁酸批次發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵。批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸濃度達(dá)到25.2 g/L，得率0.46 g/g，采用補(bǔ)料發(fā)酵，丁酸終濃度可達(dá)61.4 g/L。

固定化發(fā)酵，木薯渣水解液，丁酸，補(bǔ)料發(fā)酵

丁酸是一種重要的短鏈脂肪酸，在食品、化工、醫(yī)藥等方面有重要的應(yīng)用[1］。以其為前體生產(chǎn)的脂類可以用作食品添加劑來增加食物的香味。丁酸還能用于醫(yī)藥中間體的制備，如(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的重要中間體，可用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病。此外，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進(jìn)生長(zhǎng)。

目前，丁酸的工業(yè)生產(chǎn)以化學(xué)合成法為主，其中以間歇式丁醛氧化法[2］最為普遍，但其工藝復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重。隨著化石性資源日漸枯竭，傳統(tǒng)化工造成環(huán)境污染以及人們對(duì)生物基化學(xué)品需求的快速增加，化學(xué)工業(yè)呈現(xiàn)出從石油基到生物基的轉(zhuǎn)變趨勢(shì)。另外，由于丁酸和下游衍生產(chǎn)品有相當(dāng)比例應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)，從生物質(zhì)出發(fā)經(jīng)生物合成的丁酸(即生物丁酸)更受歡迎。目前，相關(guān)的研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。其中主要問題是生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸存在原料成本高、單位體積產(chǎn)量低和生產(chǎn)效率低等缺點(diǎn)，使其始終無法替代化學(xué)合成法。因此，研究人員一方面需要尋找和利用廉價(jià)的基質(zhì)原料，另一方面需要探索高效穩(wěn)定的發(fā)酵工藝。

為了降低發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的成本，研究者曾嘗試?yán)酶鞣N廉價(jià)原料和廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，如乳清[3］、玉米芯水解液[4］、玉米粉以及廢糖蜜[5］等。木薯渣是木薯提取淀粉后的廢棄物。目前全國(guó)每年產(chǎn)生的木薯渣為30萬t左右，除少量被用作飼料外，大量被廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)，還帶來環(huán)境污染問題。雖然以木薯淀粉及其水解物為發(fā)酵底物的研究很多[6-8］，但利用木薯渣水解液作為發(fā)酵底物的研究[9-11］較少。

利用纖維床生物反應(yīng)器[12］固定化發(fā)酵有利于提高發(fā)酵的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)效率。但是，目前這種反應(yīng)器的應(yīng)用僅限于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模，且單個(gè)使用，發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)。

本文針對(duì)以上兩個(gè)問題，研究了多柱式纖維床生物反應(yīng)器固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的可行性，并探索了以木薯渣水解液為碳源多柱式纖維床生物反應(yīng)器固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum ZJU8235)，由浙江大學(xué)生物工程研究所選育和保藏。

葡萄糖，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;硫酸銨、磷酸氫二鉀、鹽酸半胱氨酸鹽、硫酸亞鐵，上海生工生物工程有限公司;刃天青，Sigma公司;酵母粉、蛋白胨，BBI公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AnkeTGC-16C離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;YQX-II厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;5L體系發(fā)酵罐，德國(guó)B-Braun公司;6820氣相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Technology公司;紫外/可見分光光度計(jì)，Amershan Biosciences公司;AL104電子天平MP120-BLE便攜式酸度計(jì)，Mett-ler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木薯渣的預(yù)處理

在高壓蒸汽(121℃)條件下，木薯渣與0.3 mol/L H2SO4固液比1∶10，水解反應(yīng)30 min。將得到水解反應(yīng)液調(diào)pH至6.0，過濾得濾液，測(cè)定其還原糖含量。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基(1 L):30 g葡萄糖，5 g酵母粉，5 g蛋白胨，3 g(NH4)SO4，1.5 g K2HPO4，0.6 g Mg2SO4，0.03 g FeSO4，0.3 g半胱氨酸-HCl(作為還原劑)，0.5 mL 0.1%刃天青(作為無氧指示劑)，在沸水浴中煮沸除氧，培養(yǎng)基在121℃下滅菌30 min。培養(yǎng)條件為37℃，pH6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為60 g/L葡萄糖或者木薯渣水解液，其它成分與種子液相同。充氮?dú)?，保持罐中無氧環(huán)境。

1.2.3 利用纖維床生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行丁酸發(fā)酵

纖維床生物反應(yīng)器的制作方法見文獻(xiàn)[3］。本文設(shè)計(jì)的纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵系統(tǒng)由一個(gè)5 L的機(jī)械攪拌式預(yù)發(fā)酵罐、1～4個(gè)500 mL的相互串聯(lián)或并聯(lián)連接的纖維床生物反應(yīng)器以及pH控制器、循環(huán)水保溫系統(tǒng)、供氮?dú)馄康冉M成。纖維床生物反應(yīng)器和罐體構(gòu)成一個(gè)循環(huán)回路(見圖1)。整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)在121℃下滅菌30 min，通無菌氮?dú)馐构迌?nèi)達(dá)到厭氧狀態(tài)，接入100 mL種子液于5 L發(fā)酵罐內(nèi)(裝液量為2 L)，攪拌轉(zhuǎn)速控制在 150 r/min，溫度 37℃，維持pH6.0。待發(fā)酵罐中OD值達(dá)到4.0時(shí)即開啟纖維床生物反應(yīng)器，初始循環(huán)速度為60 mL/min，12 h后，流速提高到120 mL/min。

圖1 多柱并聯(lián)固定化發(fā)酵裝置圖

以葡萄糖為碳源進(jìn)行了多柱串并聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動(dòng)力學(xué)研究。批次發(fā)酵時(shí)每當(dāng)發(fā)酵液中碳源濃度接近0時(shí)，即放料并補(bǔ)入無菌新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行下一批次發(fā)酵。補(bǔ)料發(fā)酵是當(dāng)碳源濃度接近0時(shí)，補(bǔ)入高濃度葡萄糖液，直至丁酸產(chǎn)量不再提高。

在以上基礎(chǔ)上，進(jìn)行以木薯渣水解液為碳源的纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動(dòng)力學(xué)研究。在批次發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度接近0時(shí)即補(bǔ)入以木薯渣水解液為碳源的新鮮培養(yǎng)基。補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，每當(dāng)碳源濃度接近0時(shí)即補(bǔ)入濃縮的木薯渣水解液。每隔4h取樣檢測(cè)細(xì)胞濃度、底物濃度以及產(chǎn)物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體含量測(cè)定

用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm下的吸光值。

1.3.2 還原糖含量測(cè)定

將發(fā)酵液10000 r/min離心5 min后稀釋20～100倍，采用DNS法測(cè)定其中的還原糖含量。

1.3.3 丁酸和乙酸測(cè)定

采用安捷倫6820型氣相色譜系統(tǒng)檢測(cè)，以內(nèi)標(biāo)法定量分析發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度。發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心后取上清液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)物丙酸30 μL，進(jìn)樣量0.4 μL，檢測(cè)所用流動(dòng)相為高純氮?dú)猓V柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm)，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，流速為3 mL/min。測(cè)定條件:柱溫250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度250℃。

2 結(jié)果和討論

2.1 多柱串并聯(lián)固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝研究

生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等厭氧微生物經(jīng)厭氧發(fā)酵獲得。固定化發(fā)酵被證實(shí)能有效降低發(fā)酵成本并大幅提高厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物終濃度。美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器(packed bed reactor，PBR)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種簡(jiǎn)單、高效的纖維床生物反應(yīng)器，適用于厭氧性微生物發(fā)酵。但是，目前這種反應(yīng)器的應(yīng)用僅限于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模(反應(yīng)器體積小于1 L)，若單純放大體積，將無法解決復(fù)雜的多相傳質(zhì)問題和填充物強(qiáng)度不足等問題。本文嘗試在此基礎(chǔ)上，通過數(shù)個(gè)纖維床生物反應(yīng)器的串聯(lián)或并聯(lián)，以提高固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的反應(yīng)效率。

所謂的串聯(lián)是前一個(gè)纖維床生物反應(yīng)器的物料出口與下個(gè)纖維床生物反應(yīng)器的物料進(jìn)口依次連接，形成串聯(lián)式纖維床生物反應(yīng)器;而并聯(lián)是所有纖維床生物反應(yīng)器的物料進(jìn)口并聯(lián)成一個(gè)共同的物料進(jìn)口，所有纖維床生物反應(yīng)器的物料出口并聯(lián)形成一個(gè)共同的物料出口，形成并聯(lián)式纖維床生物反應(yīng)器。在各個(gè)纖維床生物反應(yīng)器的物料進(jìn)口和物料出口管道上設(shè)置泵和流量計(jì)，將預(yù)發(fā)酵罐的出料口與多聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器的物料進(jìn)口相連接，預(yù)發(fā)酵罐的進(jìn)料口與多聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器的物料出口相連構(gòu)成封閉循環(huán)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)中以葡萄糖做碳源分別進(jìn)行了2～4個(gè)纖維床生物反應(yīng)器相互串聯(lián)或相互并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸的動(dòng)力學(xué)研究，并與單柱式纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁酸進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 多柱串并聯(lián)固定化發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丁酸結(jié)果比較

從圖2中可以看出，隨著柱子數(shù)量的增加，丁酸終濃度不斷增加，相應(yīng)產(chǎn)率大幅提高。四柱并聯(lián)與單柱發(fā)酵相比，丁酸終濃度提高7.19%，產(chǎn)率提高136.7%。另外，柱子數(shù)量的增加與丁酸得率的增長(zhǎng)呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)。這可能是由于固定的菌體占總菌體量比例較大，因而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流向細(xì)胞生長(zhǎng)方向的較少。串聯(lián)模式未能明顯提高發(fā)酵液中丁酸濃度。雙柱并聯(lián)與串聯(lián)相比，產(chǎn)率高出69.32%?？赡苁且?yàn)榇?lián)模式下培養(yǎng)基流動(dòng)阻力較大，且流動(dòng)過程中pH值降低造成產(chǎn)酸速率較低。

2.2 木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝

木薯渣經(jīng)上述預(yù)處理得到木薯渣水解液，經(jīng)DNS法測(cè)定，其還原糖濃度為55.4 g/L。以木薯渣水解液為葡萄糖的替代碳源，有利于進(jìn)一步降低發(fā)酵成本。本文以木薯渣水解液為碳源進(jìn)行了四柱并聯(lián)固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果如圖3所示。對(duì)全部6個(gè)批次的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。在6個(gè)批次的丁酸發(fā)酵過程中沒有明顯的滯后期，當(dāng)新鮮培養(yǎng)基加入后，還原糖在30 h左右就被耗盡，丁酸平均濃度達(dá)到25.2 g/L，6個(gè)批次中丁酸的得率為0.46 g/g。丁酸的發(fā)酵周期平均為32 h。前3個(gè)批次周期逐漸縮短，達(dá)到穩(wěn)定。這可能是由于前2個(gè)批次纖維床生物反應(yīng)器上的菌體固定量還沒有達(dá)到最大，隨著批次的增加，菌體密度逐漸增大，生產(chǎn)效率越來越高。利用木薯渣水解液批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸的最高得率達(dá)0.52 g/g，超過了酪丁酸梭菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)丁酸的理論得率0.489 g/g。這可能是由于木薯渣水解液中的蛋白質(zhì)等其它營(yíng)養(yǎng)成分也能轉(zhuǎn)化成為丁酸發(fā)酵的底物。

圖3 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)固定化反復(fù)批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸動(dòng)力學(xué)

圖4 木薯渣水解液批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸結(jié)果比較

以木薯渣水解液為碳源固定化批次發(fā)酵產(chǎn)丁酸的終濃度明顯高于先前報(bào)道的以葡萄糖或木糖[13］為碳源的固定化批次發(fā)酵的丁酸終濃度?？赡苁怯捎谀臼碓庖褐泻幸恍┖铣膳囵B(yǎng)基中沒有的、有益于促進(jìn)發(fā)酵的天然成分，如生長(zhǎng)因子等。

與細(xì)胞膜過濾回收發(fā)酵相比，該方法解決了發(fā)酵的長(zhǎng)期穩(wěn)定性操作問題，避免了膜堵塞和污染問題。同時(shí)，使用FBB固定化發(fā)酵系統(tǒng)能夠消除滯后期，同時(shí)能夠連續(xù)多批次生產(chǎn)丁酸而不用接種新鮮種子液。由于使用FBB固定化發(fā)酵系統(tǒng)菌體生長(zhǎng)較游離時(shí)要少，因此獲得了較高的丁酸得率。另外一個(gè)可能存在的問題是木薯渣水解液中存在一些較小的不溶的固形顆?？赡軙?huì)堵塞FBB中纖維織物之間的孔隙，然而經(jīng)過6個(gè)批次的發(fā)酵流速和發(fā)酵情況沒有受到嚴(yán)重的影響。這可能是由于填充材料的孔隙足夠讓水解液中的細(xì)小顆粒通過。

2.3 木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)丁酸工藝

補(bǔ)料發(fā)酵工藝可以增強(qiáng)丁酸梭菌對(duì)丁酸的耐受性。并且通過補(bǔ)料提高發(fā)酵液中丁酸的終濃度有利于降低后續(xù)分離成本。采用濃縮木薯渣水解液進(jìn)行丁酸補(bǔ)料發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果如圖5所示。

圖5 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯(lián)固定化補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)丁酸動(dòng)力學(xué)

每當(dāng)發(fā)酵液中糖的濃度接近于0時(shí)，即補(bǔ)入濃縮的木薯渣水解液。隨著補(bǔ)料發(fā)酵的進(jìn)行，丁酸濃度不斷提高。在發(fā)酵到220 h時(shí)，丁酸濃度達(dá)到61.4 g/L，遠(yuǎn)高于上述批次發(fā)酵中的25.2 g/L。補(bǔ)料初始階段，丁酸濃度增長(zhǎng)較快。在丁酸濃度達(dá)到40 g/L后得率和產(chǎn)率下降。這說明，隨著發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度的升高，產(chǎn)物抑制作用變得明顯。

使用木薯渣水解液補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)丁酸的總產(chǎn)率略低于以葡萄糖做碳源時(shí)四柱并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸，這可能是產(chǎn)物抑制和木薯渣水解過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)積累共同作用的結(jié)果。如果我們對(duì)木薯渣水解過程可能產(chǎn)生的糖醛酸、酚類等物質(zhì)進(jìn)行分離，將有可能進(jìn)一步提高其丁酸發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

采用四柱并聯(lián)纖維床生物反應(yīng)器固定化酪丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸的發(fā)酵模式是切實(shí)可行的。相比于單柱式纖維床生物反應(yīng)器發(fā)酵，其丁酸濃度和產(chǎn)率分別提高7.19%和136.9%。這種模式將有利于解決纖維床生物反應(yīng)器單純體積放大時(shí)造成的多相傳質(zhì)問題和填充物強(qiáng)度不足等問題。尤其在后續(xù)中試及工業(yè)化過程中更多纖維床生物反應(yīng)器并聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)丁酸的模式值得繼續(xù)探索。以木薯渣水解液為碳源進(jìn)行纖維床生物反應(yīng)器四柱并聯(lián)補(bǔ)料發(fā)酵，丁酸終濃度達(dá)到61.4 g/L。這一結(jié)果優(yōu)于先前報(bào)道的采用葡萄糖[12］、玉米芯水解液[4］、廢糖蜜[5］為碳源時(shí)固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的水平。說明木薯渣水解液是一類既成本低廉，又適合于酪丁酸梭菌固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的優(yōu)質(zhì)碳源。

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ABSTRACTAs butyric acid is an important chemical raw material，using cheap non-grain biomass and FBB(fibrous-bed bioreactor)immobilized fermentation to produce butyric acid has important significance.The investigation showed that the four-column parallel immobilized fermentation technology can greatly improve the production efficiency due to the decrease of fermentation recycle to half.In the fermentation with cassava dregs hydrolysate as substrate，25.2 g/L butyric acid was obtained and the yield was 0.46g/g.At last，the production of butyric acid was increased to 61.4g/L through fed-batch fermentation.

Key wordsbrous-bed bioreactor，cassava dregs hydrolysate，butyric acid，fed-batch

Production of Butyric Acid from Casaba Dregs Hydrolysate by Immobilized Clostridium tyrobutyricum in Fibrous-bed Bioreactor

Wang Jin，Cai Jin，Shi Zhou-ming，Huang Lei，Xu Zhi-nan
(Department of Chemical Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

碩士研究生(蔡謹(jǐn)教授為通訊作者，E-mail:caij@zju.edu.cn)。

*國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2009AA02Z206)

2012-04-03，改回日期:2012-05-31