陳波，徐德平

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

蜂王漿醇溶性成分分析及其抗氧化性研究

陳波，徐德平

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

蜂王漿經(jīng)體積分數(shù)95%乙醇提取、MCI-Gel、ODS等反相色譜柱分離，得到單磷酸腺苷(AMP)和7種脂肪酸。采用1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率和總抗氧化能力試劑盒(T-AOC)等方法探索蜂王漿醇溶性物質(zhì)的抗氧化能力，結(jié)果表明:蜂王漿醇提后抗氧化活性提高，分離得到的AMP和3，10-二羥基癸酸(3，10-DDA)的抗氧化性相對較強，且清除DPPH·的IC50值分別為6.274 mg/mL和9.153 mg/mL，是蜂王漿中的抗氧化活性物質(zhì)。

蜂王漿，分離，結(jié)構(gòu)鑒定，抗氧化

蜂王漿(royal jelly，RJ)是5～15日齡的工蜂舌腺和上腭腺分泌的一種漿狀物質(zhì)，呈乳白色或淡黃色，有酸澀味，是蜂王幼蟲整個發(fā)育期和雄蜂幼蟲前期的唯一食物。蜂王漿除含有大量的蛋白質(zhì)(占干物質(zhì)的36%～55%)、糖類(20%以上)外，還有包括10-HDA在內(nèi)的許多活性物質(zhì)[1］。蜂王漿具有增強機體免疫力，延緩衰老，抗腫瘤，抗菌消炎等生理活性，廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品、保健食品[2］。

目前關(guān)于蜂王漿抗氧化能力的研究主要集中在蜂王漿抗氧化活性肽[3］和超氧化物歧化酶 SOD[4］上，對蜂王漿中蛋白質(zhì)和肽以外的其他物質(zhì)的抗氧化性研究較少。本研究用高濃度乙醇沉淀了蜂王漿中絕大部分蛋白，對得到的蜂王漿醇溶性物質(zhì)進行了分離及結(jié)構(gòu)鑒定，并研究了各組分及單一成分的抗氧化能力，旨在發(fā)現(xiàn)蜂王漿的其他抗氧化活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蜂王漿，購于南京老山藥業(yè)有限公司;GF254硅膠板，由山東煙臺芝罘化工廠生產(chǎn);總抗氧化能力(TAOC)試劑盒，南京建成生物科技有限公司生產(chǎn);1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH·)，Sigma公司提供;其他試劑皆為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器和設備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE52CS，上海亞榮生化儀器廠;暗箱式紫外透射儀ZF-90，上海顧村電光儀器廠;HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司;Brucker AVance500核磁共振儀、LCQ型質(zhì)譜儀，Thermo-Finnegan公司;TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;循環(huán)水多用真空泵(SHB-III)，鄭州長城科貿(mào)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂王漿中醇溶性物質(zhì)提取

蜂王漿10 kg，組織搗碎機搗碎，以體積分數(shù)95%乙醇為溶劑，料液比1∶4(g∶mL)，40℃提取3h，3000 r/min離心30 min，將沉淀物按上述方法重復提取2次，合并3次提取液，減壓回轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到蜂王漿醇提物(ethanol extracts of royal jelly，ERJ)。另將蜂王漿乙醇提取后沉淀物(precipitate from royal jelly，PRJ)濃縮至干，備用。

1.3.2 蜂王漿醇提物的分離

ERJ濃縮后過MCI-Gel柱(6 cm×100 cm)，流速15 mL/min，依次用去離子水、體積分數(shù)10%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液梯度洗脫，洗出液用錐形瓶收集。TLC薄層層析法跟蹤檢測洗脫液，根據(jù)Rf值將洗脫液粗分為水洗脫部分(A)、10%乙醇洗脫部分(B)、30%乙醇洗脫部分(C)、50%和70%乙醇洗脫部分(D)4個部分，95%乙醇洗脫部分由于固形物量少不做研究。減壓濃縮A、B、C、D 4部分，每部分取少量干燥備用。

1.3.3 MCI-Gel柱分離后各組分的成分分離與鑒定

將A、B、C、D 4個部分分別反復上 ODS-AQ(3 cm×100 cm)、ODS-A(3 cm×100 cm)、ODS-B(3 cm×100 cm)等色譜柱分離，用乙醇溶劑梯度洗脫，收集洗脫液，15 mL/管自動收集，采用TLC薄層法檢測，最終得到8種化合物。以二甲基亞砜為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標物，化合物經(jīng)氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其化學結(jié)構(gòu)。

1.3.4 抗氧化活性實驗

1.3.4.1 清除DPPH·自由基能力

準確稱取7.8 mg DPPH·，用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到0.2 mmol/L DPPH·溶液。將待測樣品冷凍干燥，分別制成 1、3、5、10、15 mg/mL等濃度溶液備用。參考Sun等人[5］的方法進行測定:分別取待測樣品和對照物各2 mL，各加入2 mL 0.2 mmol/L的 DPPH溶液，充分混勻，避光反應30 min后在517 nm處測吸光度(Ai);同時，取各待測樣品2 mL，分別加入2 mL無水乙醇，充分混勻，測其在517 nm處的吸光度(Aj);測定空白對照在517 nm處的吸光度(Ac)。每個樣品3次重復，取平均值。

1.3.4.2 總抗氧化能力(T-AOC)

配制10 mg/mL試樣，按照T-AOC試劑盒說明進行操作，在520 nm處測吸光度。試驗重復3次，取平均值。本實驗以樣品管與對照管在520 nm處的吸光度的差值(ΔA520)大小來反應其總抗氧化能力，差值越大，總抗氧化能力越強。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂王漿中不同組分的抗氧化活性

2.1.1 蜂王漿提取物對DPPH·清除率的測定

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有強吸收。當有自由基消除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學計量關(guān)系的[6］。因此通過檢測517 nm處吸光度的變化，可以反映其消除自由基的能力，而能力的大小用抑制率表示。蜂王漿中不同組分的DPPH·清除能力如圖1所示。

蜂王漿醇提物(ERJ)清除DPPH·能力提高，而醇提后沉淀物(PRJ)的DPPH·清除率較低，表明蜂王漿中具有清除DPPH·能力的物質(zhì)主要存在于ERJ中。ERJ經(jīng)MCI-Gel柱分離后，水洗脫部分(A)和10%乙醇洗脫部分(B)的DPPH·清除率高于ERJ，分別達到了68.9%和50.1%，C、D清除率比ERJ低。

圖1 蜂王漿中不同組分清除DPPH·能力

2.1.2 蜂王漿提取物總抗氧化能力(T-AOC)的測定

對總抗氧化能力的測定時利用抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與菲林類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡合物的性質(zhì)，通過比色法可以測定樣品抗氧化能力的強弱。測定管與對照管吸光度差值越大，抗氧化能力越強?？疾旄鞣渫鯘{提取物在相同濃度下的總抗氧化能力，結(jié)果見圖2。

圖2 蜂王漿中不同組分總抗氧化能力

由圖2可知，相同濃度下，各組分的總抗氧化能力強弱順序依次為:B＞A＞ERJ＞RJ＞C＞D＞PRJ。這與清除DPPH·能力相一致，表明蜂王漿中抗氧化活性物質(zhì)溶于乙醇，且主要集中在組分A、B中。

2.2 MCI-Gel柱分離后各組分的成分

將 ERJ經(jīng) MCI-Gel柱分離，得到 A、B、C、D4個組分，各組分再經(jīng)ODS-AQ、ODS-B等反相色譜柱柱分離，得到8種化合物，結(jié)果見表1。

由表1，從A、B、C、D中分別分離得到2種化合物，其中化合物2～8為脂肪酸。通過TLC法檢測，得知這8種化合物的Rf值依次增大，說明化合物1～8的極性是逐漸變小的。其中，A中分離出的化合物1(AMP)是生物體代謝的能量源泉，是參與遺傳信息貯存、遺傳與表達的核酸構(gòu)件，RJ中含量在5.9～2057.4 mg/kg[7］;化合物 6，又稱王漿酸，目前只發(fā)現(xiàn)在蜂王漿中存在，占新鮮蜂王漿的1.4%～2.0%，是蜂王漿中的標志性物質(zhì)[8］。化合物 2、5、6、7、8 是 RJ中的短鏈脂肪酸，這些脂肪酸是RJ中一組特殊的C10羥基脂肪酸[9］，Dragana Vucevic等曾報道 RJ中的短鏈脂肪酸對機體具有免疫調(diào)節(jié)作用[10］。

表1 ERJ色譜柱柱分離結(jié)果

2.3 蜂王漿醇溶性物質(zhì)中各單一成分的抗氧化活性分析

由于分離得到的化合物在含量上有較大差異，有些化合物量較少無法進行活性試驗，所以本研究對磷酸腺苷、3，10-2-羥基癸酸(3，10-DDA)、王漿酸(10-HDA)、10-羥基癸酸(10-HDAA)、9-羥基癸酸(9-HDAA)、8-羥基癸酸(8-HDAA)等6種物質(zhì)進行了抗氧化活性的分析。

2.3.1 蜂王漿醇溶性物質(zhì)中單一成分清除DPPH·自由基能力的測定

對蜂王漿醇溶性物質(zhì)中分離得到的6種物質(zhì)進行清除DPPH·能力的測定。結(jié)果見圖3。

圖3 蜂王漿醇溶物中各成分清除DPPH·能力

由圖3可見，每種物質(zhì)對DPPH·均具有一定的清除能力，且隨著各物質(zhì)的濃度增加，對DPPH·的清除能力也逐漸增加，具有良好的劑量效應關(guān)系。在濃度15 mg/mL時，10-HDAA、9-HDAA、8-HDAA 等的DPPH·清除率較低，均未達到30%，而AMP和3，10-HDAA在15 mg/mL時清除率分別達到了89.1%和78.3%。經(jīng)計算，AMP的IC50值為6.274 mg/mL，3，10-DDA 的 IC50值為9.153 mg/mL。

2.3.2 總抗氧化能力(T-AOC)

對蜂王漿醇溶性物質(zhì)中分離得到的6種物質(zhì)進行總抗氧化能力的測定。結(jié)果見圖4。

圖4 蜂王漿醇溶性中各組分總抗氧化能力

由圖4可知，AMP和3，10-DDA的總抗氧化能力很高，比較圖2分別約是RJ抗氧化能力的3.4倍和6.5倍。另外，由于A的總抗氧化能力比B強，而A中分離出來的AMP的總抗氧化能力比B中的3，10-DDA弱，有理由相信A中有其他高抗氧化活性物質(zhì)存在，可能是小分子物質(zhì)BHT[11］或者一些酚類物質(zhì)[12］，需要作進一步研究。10-HDA雖然是蜂王漿的標志物質(zhì)，具有生物活性，但其抗氧化能力比較弱，這與Yoshimi等的研究結(jié)果一致[13］。

3 結(jié)論

蜂王漿經(jīng)體積分數(shù)95%乙醇提取所得的醇溶性成分抗氧化活性比原漿強，而醇提后的沉淀物抗氧化活性很低。經(jīng)MCI-Gel、ODS等反相色譜柱分離，發(fā)現(xiàn)醇溶性物質(zhì)中含有 AMP、3，10-DDA、10-HDA、10-HDAA、9-HDAA、8-HDAA等成分。研究發(fā)現(xiàn)，提取物中極性較小的短鏈脂肪酸的抗氧化活性較弱，王漿酸的抗氧化能力不高，而AMP、3，10-DDA具有強的抗氧化活性，其清除 DPPH·的 IC50值分別是6.274 mg/mL和9.153 mg/mL，是蜂王漿中的抗氧化活性物質(zhì)。除此以外，蜂王漿中肯定還有其他抗氧化物質(zhì)存在，需要作進一步研究。

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ABSTRACTAfter royal jelly(RJ)was extracted with 95%ethanol and isolated with chromatographic columns MCI-Gel and ODS，adenosine monophosphate and 7 kinds of fatty acids were obtained.The scavenging free radicals(DPPH·)of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and the total antioxidant capacity kit(T-AOC)were used to study antioxidation of alcohol soluble components.The results showed that antioxidation of royal jelly improved after extraction and the antioxidant activity of AMP and 3，10-dihydroxydecanoic acid(3，10-DDA)were relatively higher，IC50value for DPPH· scavenging activity were 6.274 mg/mL and 9.153 mg/mL respectively.They were identified as the Antioxidants in royal jelly.

Key wordsroyal jelly，isolation，structural determination，antioxidation

Structure and Antioxidation Studies of Alcohol Soluble Components in Royal Jelly

Chen Bo，Xu De-ping
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(徐德平副教授為通訊作者，E-mail:xdp1219@sina.com)。

2012-06-05，改回日期:2012-06-26