鐘泓波，黃嬋媛，尹文穎，趙謀明，崔春

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

不同分子質(zhì)量段小麥面筋蛋白酶解液對美拉德反應(yīng)物風(fēng)味的影響*

鐘泓波，黃嬋媛，尹文穎，趙謀明，崔春

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

用超濾法將小麥面筋蛋白酶解液根據(jù)分子質(zhì)量大小分為大于10 ku(M1)，5～10 ku(M2)，3～5 ku(M3)，1～3 ku(M4)，小于1 ku(M5)5個組分，研究這5個組分對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的影響。結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要風(fēng)味物質(zhì)是醛類，并且高分子量段美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中高級醛種類較多，而游離氨基酸和小分子寡肽參與美拉德反應(yīng)主要生成吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)。分子質(zhì)量段為3～5 ku(M3)的膜分離組分，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物鮮味氨基酸含量較高，苦味氨基酸含量較低，鮮味突出，醇厚味明顯。

小麥面筋蛋白酶解液，美拉德反應(yīng)，風(fēng)味

小麥面筋蛋白(俗稱谷朊粉，活性蛋白粉)是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，蛋白含量高，其中清蛋白占3%～5%，球蛋白占6%～10%，醇溶蛋白占40%～50%，谷蛋白占30%～40%。但是，因為小麥面筋蛋白分子疏水性強，溶解度低，限制了其應(yīng)用范圍[1-2］。為了提高和拓寬小麥面筋蛋白的功能特性，采用酶解技術(shù)手段對小麥面筋蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)加以改造，可獲得多肽組分[3］。

美拉德反應(yīng)過程會生成大量的風(fēng)味物質(zhì)，在近幾十年來一直是許多領(lǐng)域的研究熱點。食品原料中一般都含有還原糖、淀粉、氨基酸，在加熱過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)可產(chǎn)生具有各種香味特征的香味物質(zhì)。Spanier的研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生特定風(fēng)味化合物時，水解蛋白的游離氨基酸的組成與含量、分子量分布、多肽的組成及化學(xué)構(gòu)型等對美拉德反應(yīng)中形成的風(fēng)味物質(zhì)的種類等具有非常重要的影響[4-5］。近年來，國內(nèi)外對小麥面筋蛋白的研究有一些報道[6-8］，但對于小麥面筋蛋白及其酶解液對美拉德反應(yīng)風(fēng)味的影響研究未見報道。

本研究利用超濾技術(shù)將小麥面筋蛋白酶解液分離為不同分子量段，分別與還原糖進行美拉德反應(yīng)，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，研究不同分子量段酶解液對美拉德反應(yīng)物風(fēng)味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麩皮、面粉，市售;小麥面筋蛋白，河南蓮華味精集團;曲精，滬釀3.042米曲霉孢子粉，孢子發(fā)芽率≥80%，孢子數(shù)≥100億/g干基，水分≤10%;超濾膜:截留分子量分別為 10000 u，5000 u，3000 u，1000 u;還原糖:木糖，廣東匯香源生物科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

恒溫振蕩培養(yǎng)箱BSD-150，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-25數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;密理博超濾系統(tǒng)，美國Millipore公司;DSQⅡ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司;100 μm PDMS固相微萃取頭，美國SUPELCO公司;高效液相色譜儀，美國Waters公司;R2L-100KPS真空冷凍干燥機，日本Kyowa公司;TIM840自動電位滴定儀，上海摩達科學(xué)器材公司;SHZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市恒豐儀器廠;GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米曲霉的培養(yǎng)

麩皮、面粉、水按照4∶1∶4的質(zhì)量比裝入250 mL錐形瓶中，塞上棉塞，121℃滅菌20 min，冷卻接種，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.2 酶液提取

將固態(tài)發(fā)酵成熟的米曲霉曲粉碎，過20目篩，加入10倍體積的去離子水，于40℃浸提30 min，濾紙過濾，即得粗酶液。向粗酶液中添加硫酸銨，使其飽和度達到40%，4℃靜置過夜，冷凍離心。取上清液，并添加硫酸銨至其飽和度為80%，4℃靜置過夜，冷凍離心，取沉淀，透析除鹽，用福林酚比色法[9］測其中性蛋白酶活性。

1.2.3 酶解

在小麥面筋蛋白懸浮液中，加入米曲霉酶液，加酶量為800 U/g蛋白，于50℃酶解36h。100℃滅酶，并離心15 min，取上清液。此酶解液的氨基酸轉(zhuǎn)化率為61.83%，蛋白質(zhì)回收率為74.78%。其中氨基酸轉(zhuǎn)化率為酶解液的上清液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量與上清液中總氮的質(zhì)量之比，蛋白質(zhì)回收率為酶解液的上清液中蛋白的質(zhì)量與原料中蛋白的質(zhì)量之比。

1.2.4 膜超濾工藝流程

取小麥面筋蛋白酶解液的上清液，冷卻至25℃左右，取1500 mL的酶解產(chǎn)物依次通過MWCO為10、5、3和1 ku的膜，采用密理博超濾系統(tǒng)間歇式全回流操作工藝進行超濾分離，透過液進入下一級膜，而截留液循環(huán)進行分離。酶解產(chǎn)物通過膜超濾的詳細(xì)流程參見圖1。

圖1 膜分離流程

1.2.5 冷凍干燥

將不同分子量段的酶解產(chǎn)物(原液，大于10 ku，5k～10 ku，3k～5 ku，1k～3 ku，小于1ku)進行冷凍干燥，并儲存于-18℃。

1.2.6 美拉德反應(yīng)

分別取經(jīng)冷凍干燥的原液和各截留組分(大于10 ku，5k～10 ku，3k～5 ku，1k～3 ku，小于1 ku)4 g，與1 g木糖在120℃反應(yīng)2 h，得到6個美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，分別命名為 M-control，M1，M2，M3，M4，M5。

1.3 分析方法

1.3.1 總氮含量的測定

凱氏定氮法[10］。

1.3.2 氨基酸分析

采用美國Waters高效液相色譜儀，PICO.TAG氨基酸分析柱，38℃，檢測波長254 nm，流速為1 mL/min條件進行氨基酸分析。色氨酸的分析則是將樣品堿解后再用HPLC分析。

參照 Hughes等[11］的方法，略微修改，操作如下:以異硫氰酸苯酯(PITC)進行柱前衍生化。將三乙胺(TEA)溶液(TEA-水-乙醇 =1∶2∶2，V∶V∶V)加到樣品中，真空條件下?lián)]發(fā)干，然后加入 PITC溶液(PITC-乙醇-TEA-水 =1∶7∶1∶1，體積比)室溫下反應(yīng)20 min。取50μL樣品上柱，利用pH6.4醋酸鈉緩沖液(洗脫液A)以及60%(v/v)乙腈水溶液(洗脫液B)進行梯度洗脫。洗脫步驟如下:0～10 min，線性洗脫(0～46%B);10～12 min，線性洗脫(46%～100%B);12～15 min，等速洗脫(100%B)。

1.3.3 SPME-GC-MS分析條件

色譜條件:色譜柱:Tr-35ms彈性石英毛細(xì)管(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min升溫至230℃，保持5 min。載氣:He;載氣流量:1.0 mL/min;分流進樣，分流比10∶1。

質(zhì)譜條件:離子源:EI離子源;離子源溫度:250℃;傳輸線溫度275℃;電子能量:70 eV;質(zhì)量范圍:m/z 33～450 amu。

萃取條件:CAR/PDMS萃取頭270℃老化10 min。取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物5 g置于50 mL萃取瓶，加入10 mL飽和NaCl溶液，60℃振蕩萃取30 min，230℃解吸3 min。

1.3.4 呈味分析

取各分子量段的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，添加1%NaCl混合均勻，在常溫下進行感官評定。根據(jù)國標(biāo)GB/T 14195-1993 標(biāo)準(zhǔn)和 Ogansawara[12］、Lion 等[13］的方法，由10個有經(jīng)驗的專業(yè)人士根據(jù)不同酶解液比較打分。以谷氨酸鈉溶液(鮮味，0.6 g/L)、蔗糖溶液(甜味，35 g/L)、乳酸(酸味，1.65 g/L)、L-異亮氨酸(苦味，5 g/L)為標(biāo)準(zhǔn)溶液進行感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量段的總氮含量

由表1可知，小麥面筋蛋白酶解液經(jīng)膜分離后，大于10 ku的截留組分氮得率最高，并且氮得率隨分子量的減少呈下降趨勢?？赡芘c超濾的原理有關(guān)，由于截留較大分子量組分時，超濾膜孔徑大，所需壓力小，酶液容易穿過，但隨著截留組分分子量的逐漸減小，所需超濾膜的孔徑也越來越小，超濾所需的壓力就越來越大，并且需要更長的時間分離，因此，小分子量段的氮得率較低。

表1 膜超濾后各組分的總氮含量

2.2 不同分子量段小麥面筋蛋白酶解液的總氨基酸分析

肽的分子量大小以及氨基酸組成會影響到其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味。由表2分析可知，原液以及小麥面筋蛋白酶解液各超濾組分中谷氨酸含量均最高，一般占總氨基酸的20%～40%，其中M2和M3中谷氨酸含量最高。原液以及小麥面筋蛋白酶解液各超濾組分中半胱氨酸含量均最低，且不同分子量段組分相差較大，M4組分中半胱氨酸含量僅為52.98 mg/100 mL，而M1組分中半胱氨酸含量達到256.57 mg/mL。

表2 各截留組分的氨基酸總量分析單位:mg/100 mL

2.3 不同分子量段美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味分析結(jié)果

2.3.1 整體風(fēng)味物質(zhì)

圖2 小麥面筋蛋白酶解物各組分美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味分析

由圖2可知，原液以及各分子量段截留組分的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，醛類物質(zhì)相對含量在50%以上，顯著高于其他風(fēng)味物質(zhì)，是小麥面筋蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要風(fēng)味物質(zhì)，其中分子量在5k～10 ku的M2組分美拉德反應(yīng)物中醛類風(fēng)味物質(zhì)含量最高，分子量大于10 ku的M1組分美拉德反應(yīng)物次之，而分子量小于1 ku的M5組分美拉德反應(yīng)物中醛類風(fēng)味物質(zhì)含量最低。小麥面筋蛋白酶解液原液以及各分子量段截留組分的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，酮類風(fēng)味物質(zhì)含量最低，一般不超過風(fēng)味物質(zhì)總量的5%，且各組分美拉德反應(yīng)物相差不大。而對吡嗪、呋喃以及其他風(fēng)味化合物而言，分子量小于1 ku的M5組分美拉德反應(yīng)物含量較高，顯著高于高分子量組分的美拉德反應(yīng)物。由此可知，具有特征風(fēng)味的雜環(huán)類物質(zhì)，在小分子量段截留組分與還原糖反應(yīng)時更易得到。

2.3.2 醛類物質(zhì)

小麥面筋蛋白酶解液原液以及各分子量段截留組分的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物生成的風(fēng)味物質(zhì)中，醛的種類隨著分子量的降低而呈減少趨勢，其中M1組分中醛類物質(zhì)的總類達到17種，而M5組分中醛類物質(zhì)的種類最少，僅有10種，并且不含己醛、庚醛、辛醛、壬醛等高級醛。高級醛在較大分子量段截留組分中種類較多，如表3。然而特殊的風(fēng)味一般存在于高級醛中，例如庚醛、辛醛等具有果子香味，壬醛具有玫瑰香味。在原液以及各分子量段截留組分的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物所檢測出的醛類物質(zhì)中，2-呋喃甲醛、苯甲醛、苯乙醛和3-甲基丁醛的含量較高。

表3 小麥面筋蛋白酶解物各組分美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)中醛類物質(zhì)的分析

2.3.3 吡嗪

隨著分子量的降低，與還原糖進行美拉德反應(yīng)生成的風(fēng)味物質(zhì)中吡嗪類的種類呈現(xiàn)增多的趨勢，其中2，5-二甲基吡嗪含量最高。大分子量段截留組分M1、M2中僅含有2種吡嗪類物質(zhì)，而小分子量段截留組分M5中含有吡嗪類物質(zhì)高達15種，由此可知，游離氨基酸和小分子量寡肽參與美拉德反應(yīng)主要生成吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)，如表4。

表4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味物質(zhì)中吡嗪類物質(zhì)的分析

2.4 不同分子量段美拉德反應(yīng)組分的感官評價

由圖3分析可知，就鮮味而言，感官強度大小為M3的鮮味最強，并且高于未經(jīng)膜超濾的原液反應(yīng)產(chǎn)物，其次為M-control、M2、M4、M1、M5;就持續(xù)性而言，M-control、M3、M4、M5感官持續(xù)性均較長，大分子量段截留組分M1、M2相對較差，分析原因可能是味蕾細(xì)胞更容易吸收較小分子;醇厚味方面，不同分子量段截留組分之間的評價差異并不明顯，原液和M3醇厚味較好，其余各個組分基本一致;酸味方面，基本呈現(xiàn)隨著分子量的減小，酸味強度增強的趨勢，M1酸味最弱，M5最強，M-control酸味強度位于M1、M2之間;苦味方面，經(jīng)膜分離后不同分子量段表現(xiàn)出苦味增強，均高于M-control，可能由于M-control中各組分拮抗或協(xié)同增效作用，苦味不是特別明顯;甜味方面，M3的甜味最弱，其余各組分差別不大。

綜上，M3的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，因其具有較強的鮮味和醇厚，并且苦味、甜味最弱，而具有良好的潛力開發(fā)成呈味基料。

圖3 各美拉德反應(yīng)組分的感官評價

3 結(jié)論

小麥面筋蛋白酶解液經(jīng)膜分離后，發(fā)現(xiàn)高分子量段含氮率增大。將不同分子量段的酶解液與還原糖進行美拉德反應(yīng)，對產(chǎn)物進行風(fēng)味分析，發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)是組成小麥面筋蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的主要風(fēng)味物質(zhì)，吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)主要由游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)生成。

根據(jù)感官評價的結(jié)果，可知分子量段為3k-5 ku的膜分離組分，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物鮮味最突出，醇厚味明顯，并且從氨基酸分析可見其鮮味氨基酸含量較高，苦味氨基酸含量較低。

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ABSTRACTThe wheat gluten enzymatic hydrolysis was separated by membrane ultrafiltration into five fractions with different molecular weight as follows:more than 10 ku(M1)，5k-10 ku(M2)，3k-5 ku(M3)，1k-3 ku(M4)，less than1ku(M5).And the influence of five components of the Wheat Gluten Enzymatic Hydrolysis on the flavor of Maillard reaction products was investigated.The results showed that aldehydes were the main compounds contained in the Maillard reaction products(MRPs)from wheat gluten.And there were more varieties of senior aldehyde in high molecular weight than that in low molecular weight.Pyrazines were formed by free amino acids and oligopeptides reacted in the Maillard reaction.Compared with other components，in the MRPs of peptides between 3k and5ku(M3)had a better umami taste and mellow feeling due to its higher contents of amino acids with umami taste and lower contents of amino acids with bitter taste.

Key wordswheat gluten enzymatic hydrolysis，Maillard reaction，flavor

The Influence of Different Molecular Weight of the Wheat Gluten Enzymatic Hydrolysis on the Flavor of Maillard Reaction

Zhong Hong-bo，Huang Chan-yuan，Yin Wen-ying，Zhao mou-ming，Cui Chun
(College of Light Industry and Food Engineering，South China University of Technology，Guang Zhou 510640，China)

碩士研究生(崔春副教授為通訊作者)。

*中央高校(No.2012ZM0074);食品香料香精制備關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化(No.2011BAD23B01)

2012-03-18，改回日期:2012-05-03