劉劍，徐達(dá)

(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶，526060)

溶解氧控制對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的影響

劉劍，徐達(dá)

(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東肇慶，526060)

在50 L的生物反應(yīng)器中，通過控制溶解氧水平為5%、10%、20%、30%四個水平考察枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株生長的溶解氧濃度在10%～20%。并通過發(fā)酵過程中菌株的生長情況、菌體攝氧率和發(fā)酵產(chǎn)苷進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中DO水平控制在10%～20%時腺苷積累量高，發(fā)酵液中DO水平為5%和30%均不利于發(fā)酵液中的腺苷積累。通過對發(fā)酵終點(diǎn)丙酮酸的檢測，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在低溶氧狀態(tài)下比高溶氧狀態(tài)下積累更多的丙酮酸。在此基礎(chǔ)上，提出兩階段DO控制策略，最終腺苷積累量達(dá)到20.1 g/L。

枯草芽孢桿菌，發(fā)酵，腺苷，溶解氧

腺苷(Adenosine)又稱腺嘌呤核苷，具有促進(jìn)冠狀動脈擴(kuò)張及心肌代謝的機(jī)能，擴(kuò)張血管，增加冠血量的藥理作用，可用于治療冠狀血管障礙、狹心癥、動脈硬化癥及高血壓癥等疾病，具有廣泛的藥用價值。此外，腺苷是合成阿糖腺苷、腺苷酸(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，是一種重要的醫(yī)藥原料[1-2］。從1968年小西真八[3］利用枯草桿菌的異亮氨酸缺陷型發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷后，發(fā)酵法是生產(chǎn)腺苷主要的方法，常用的菌種是枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌屬于好氧微生物，對氧的需求量較高，但其在不同溶氧條件下仍具有不同的生理特性，因此溶氧濃度作為有氧控制的一個關(guān)鍵因素，直接影響腺苷的生產(chǎn)水平[4］。通常而言，在生產(chǎn)嘌呤核苷產(chǎn)物時需要大風(fēng)量，以保證發(fā)酵液中高的溶氧(DO)和低的CO2分布，但是，細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的合成都存在一個最適DO值，較低的DO值會限制細(xì)胞生長和代謝物合成，較高的DO也可能對細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不利作用。因此，通過控制發(fā)酵液中的DO水平，同時監(jiān)測分析發(fā)酵進(jìn)氣、排氣中的O2、CO2含量，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中菌體生長代謝的變化情況[5-8］。根據(jù)張嗣良教授的多尺度微生物過程優(yōu)化理論[9］的發(fā)酵過程參數(shù)相關(guān)分析原理，通過控制50 L的生物反應(yīng)器中發(fā)酵液DO值在5%、10%、20%、30%四個不同水平，研究了不同溶解氧水平對菌體代謝活力及腺苷發(fā)酵產(chǎn)苷的影響，為腺苷工業(yè)生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)M-090，遺傳標(biāo)記為:黃嘌呤缺陷型(Xan-)，8-氮雜鳥嘌呤抗性，星湖生物科技股份有限公司腺苷生產(chǎn)菌株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖10，酵母膏10，蛋白胨5，玉米漿5，尿素2，NaCl 2.5;pH 7.0～7.2。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖120，酵母膏10，酵母粉8，玉米漿5，K2HPO42，MgSO44，(NH4)2SO420，Ca2CO320(分消);pH 7.0～7.2。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化

取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，30℃恒溫靜置培養(yǎng)20～24 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

250 mL錐形瓶中培養(yǎng)基裝量20 mL，34℃，100 r/min，培養(yǎng)12 h。

1.3.350 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵液裝量35 L，接種量8%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)。定時測定和記錄腺苷含量、DO值、OUR等參數(shù)。

1.4 分析方法

1.4.1 腺苷定量測定方法

Waters HPLC，Agilent Zorbax SB-Aq column(150 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.4.2 溶氧測定

Mettler Toledod在線溶氧檢測系統(tǒng)。

1.4.3 尾氣中O2、CO2含量測定

分別用順磁氧分析儀(Magnos 4G，德國H＆B公司生產(chǎn))與不分光紅外儀(Uras 3G，德國H＆B公司生產(chǎn))在線測定。

1.4.4 菌體濃度的測定

吸取樣品0.2 mL，用2 mol/L HCl溶液稀釋20倍，搖勻后測定600 nm下的吸光度。

1.4.5 丙酮酸的測定

Waters HPLC，Agilent Zorbax SB-Aq column(150 mm×4.6 mm，5 μm)流動相0.001 mol/L H3PO4，流速0.6 mL/min，柱溫35℃，檢測波長210 nm。所有試劑均為色譜純。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺苷發(fā)酵過程的臨界氧濃度

在發(fā)酵過程中，隨著菌體代謝的加劇，OUR逐漸上升，造成DO不斷下降，當(dāng)DO與OUR反向變化時，表明工程水平的供氧對發(fā)酵不是限制因素。從腺苷發(fā)酵過程OUR和DO變化曲線圖(圖1)可以看出，發(fā)酵進(jìn)行到8 h，DO跌至10%左右，此時OUR形成第1個峰值后轉(zhuǎn)而下降，DO與OUR出現(xiàn)順峰現(xiàn)象，表明此時DO已低于滿足菌體呼吸要求的最低濃度，菌體代謝受到抑制[10］。從曲線初步判斷氧濃度在20%以下在一定程度上影響了菌體細(xì)胞的呼吸(OUR)，因此我們把當(dāng)DO降到20%以下時的DO值作為腺苷發(fā)酵過程中的臨界氧濃度。

2.2 不同溶氧水平對腺苷發(fā)酵過程的影響

圖1 發(fā)酵過程OUR和DO變化曲線圖

發(fā)酵過程中菌體的生長受到不同的DO控制水平的影響如圖2(a)所示，DO控制在10%和20%的菌體濃度在29左右，而DO控制5%的菌體濃度比DO控制在10%和20%的菌體濃度降低15%左右，說明在限制氧濃度下，菌體生長明顯受到抑制。發(fā)酵DO控制在30%菌體濃度在36 h略高于DO控制在10%和20%的菌體濃度，而36 h后菌體濃度比DO控制在10%和20%的菌體濃度高出10%左右。不同的DO控制水平對腺苷積累量的影響如圖2(b)，在限制氧濃度下(DO在5%左右)，發(fā)酵28 h后，腺苷產(chǎn)物積累量基本不增加，僅為10.83 g/L。DO控制在10%和20%腺苷產(chǎn)率分別達(dá)18.25 g/L和19.07 g/L。發(fā)酵DO控制在30%，雖然前期產(chǎn)物積累較快，但后期增長緩慢，最終產(chǎn)物量為16.87 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DO控制適當(dāng)水平(在10%～20%)，發(fā)酵過程的產(chǎn)物積累呈穩(wěn)定增加的趨勢，發(fā)酵液中產(chǎn)苷水平最高。而溶氧水平控制太低，則影響菌體生長，菌體活力下降，代謝緩慢，產(chǎn)量下降。而溶氧控制過高導(dǎo)致前期菌體快速生長，菌體容易衰老，導(dǎo)致產(chǎn)物積累量減少。

圖2 不同的DO控制條件下菌體濃度和腺苷積累量

2.3 不同溶氧水平控制下腺苷發(fā)酵過程攝氧率表現(xiàn)

如圖3所示，在發(fā)酵過程中分別控制DO在5%、10%、20%、30%等4個不同的水平檢測菌體的攝氧率。DO在5%時，菌體的攝氧率30～40 mmol/(L·h)，在發(fā)酵中后期(30 h后)，菌體的攝氧率呈下降趨勢，50 h之后菌體的攝氧率已低于20 mmol/(L·h);DO在10%～20%，產(chǎn)物積累期的菌體的攝氧率比較平穩(wěn)，基本處于30～40 mmol/(L·h);而DO在30%時，發(fā)酵前期菌體的攝氧率較高，略高于40 mmol/(L·h)，但在發(fā)酵中后期攝氧率下降幅度加大，與DO在5%時出現(xiàn)的情況類似。50 h之后，菌體的攝氧率已低于20 mmol/(L·h)。通過對4個溶氧控制之下，腺苷發(fā)酵過程攝氧率的比較發(fā)現(xiàn)，5%DO在36 h后，30%DO在42 h后菌體的攝氧率均低于30 mmol/(L·h);而DO在10%和DO在20%時，54 h后攝氧率才低于30 mmol/(L·h)水平。由此可見，DO水平控制在10%～20%時，有利于菌體維持生長活力，有利于產(chǎn)物積累;DO過低(5%左右)會抑制菌體活力，DO過高(30%左右)，發(fā)酵前期呼吸代謝旺盛，但發(fā)酵后期菌體容易衰老，活力不足，DO過低和過高均對產(chǎn)物積累造成影響。

圖3 不同DO條件下菌體攝氧量

2.4 不同溶氧水平控制下發(fā)酵終點(diǎn)的丙酮酸積累水平

通過檢測不同溶氧條件下的丙酮酸積累水平，如圖4所示，結(jié)果反映了在低溶氧控制下(10%～20%)丙酮酸水平比30%溶氧控制下的丙酮酸水平要高，而5%丙酮酸水平較低的原因是菌體生長受到了抑制。這個結(jié)果和Wen-Bang Yu等[10］研究結(jié)果相吻合，他們從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度指出，枯草芽孢桿菌在低溶氧條件下能上調(diào)碳代謝途徑上的基因表達(dá)，如葡萄糖代謝、丙酮酸代謝等，從而提高碳代謝的利用率，提高腺苷產(chǎn)量。

2.5 發(fā)酵過程控制DO對腺苷產(chǎn)量的影響

為了提高整個培養(yǎng)過程中腺苷產(chǎn)率，提出兩階段控制的策略。在發(fā)酵前期(0 h～24 h)，控制DO水平在30%～40%;發(fā)酵24 h后控制DO在10%～20%。通過在發(fā)酵過程不同階段控制不同的DO水平，來得到提高腺苷產(chǎn)量的目的。圖5顯示了在50 L發(fā)酵罐中采用兩階段DO控制策略，整個發(fā)酵過程中菌體的攝氧率變化曲線以及腺苷積累曲線，最終腺苷積累量為20.1 g/L。

圖4 不同溶氧條件下的丙酮酸積累水平(n=3，SD)

圖5 發(fā)酵過程DO變化與腺苷積累關(guān)系

發(fā)酵前期控制較高的DO水平，由于菌體代謝活力的增加，初始產(chǎn)物的積累得到相應(yīng)的提高;發(fā)酵中后期DO控制在10%～20%，菌體攝氧率(OUR)平穩(wěn)，產(chǎn)物代謝途徑正常，腺苷產(chǎn)物的積累穩(wěn)步增長。

3 結(jié)論

對微生物發(fā)酵來說，溶解氧是發(fā)酵過程中需要考慮的重要因素，氧的不足會造成代謝異常，產(chǎn)量降低，而溶氧過高雖滿足了菌體生長的需求，但未必能控制菌株經(jīng)濟(jì)利用，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[11-13］。本文通過控制不同溶氧水平對腺苷生產(chǎn)菌——枯草芽孢桿菌的研究，表明控制發(fā)酵的溶解氧濃度在10%～20%之間，能控制菌體生長，菌體的攝氧率平穩(wěn)處于30～40mmol/(L·h)，從而使發(fā)酵過程的產(chǎn)物積累呈穩(wěn)定增加的趨勢，達(dá)到較高的水平。通過檢測不同溶氧條件下的丙酮酸積累水平，也印證了枯草芽孢桿菌在低溶氧條件下能提高碳代謝的利用率，從而提高腺苷產(chǎn)量。文章通過兩個階段控制的策略，在發(fā)酵前期(0h～24h)，控制DO水平在30%～40%，發(fā)酵24 h后控制DO在10%～20%，最終腺苷積累量達(dá)到20.1g/L?？莶菅挎邨U菌是一種應(yīng)用非常廣泛的工業(yè)微生物，本文的研究可為枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)其它品種起到參考作用。

[1]柏建新，張一平，朱曉宏，等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的研究[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(3):16-20.

[2］張克旭，陳寧，張蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998.

[3]Konishi S，Kubota K，Aoki R，et al.Studies on the production of purine hucleotides[J］.Amino Aoid and Nucleic Acid，1968，18(15):22-24.

[4]Kole MM，Draper I，Gerson DF.Protease production by Bacillus subtilis in oxygen-controlled，glucose fed-batch fermentations[J］.Appl Microbiol Biotechnol，1988，28:404-408.

[5]林開建，鄭慶建.溶解氧濃度對多粘菌素發(fā)酵影響的研究[J］.化學(xué)工程與設(shè)備，2007(1):47-49.

[6]葛飛，黃寅，桂琳.溶解氧對細(xì)腳擬青霉小試發(fā)酵過程及胞內(nèi)核苷積累的影響[J］.食品工業(yè)科技，2010，31(7):180～186.

[7]張建勇，王曉港，王水蓮，等.溶氧對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的影響[J］.齊魯藥事，2007，26(7):428-430.

[8]Papagianni M.Effects of dissolved oxygen and pH levels on weissellin A production by Weissella paramesenteroides DX in fermentation[J］.Bioprocess Biosyst Eng，2012，DOI 10.1007.

[9］張嗣良，儲炬.多尺度微生物過程優(yōu)化[M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:94.

[10]Yu Wen-Bang，Gao Shu-Hong，Yin Chun-Yun，et al.Comparative transcriptome analysis of Bacillus subtilis responding to dissolved oxygen in adenosine fermentation[J］.PLoS ONE，2011，6(5):e20092.DOI 10.1371.

[11]王恒偉，陳長華，付水林，等.腺苷發(fā)酵液中有機(jī)酸的代謝規(guī)律[J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30(2):223-226.

[12]Calik P，Calik G，Ozdamar TH.Oxygen transfer effects in serine alkaline protease fermentation by Bacillus licheniformis:use of citric acid as the carbon source[J］.Enzyme and Microbial Technology，1997，23(7-8):451-461.

[13]Li Y，Hugenholtz J，Chen J et，al.Enhancement of pyruvate production by Torulopsis glabrata using a two-stage oxygen supply control strategy[J］.Chemistry and Materials Science，2002，60:101-106.

ABSTRACTThe effect of oxygen supply on adenosine production of Bacillus subtilis was studied using 50L fermentor with the air saturation at 5%，10%，20%and 30%.We found that the concentration of the critical dissolved oxygen in the industrial strains was 10%～20%.The relationship among strain growths，oxygen uptake rate in the process and dissolved oxygen(DO)tension on adenosine accumulation was analyzed.The results showed that during the adenosine fermentation of Bacillus subtilis，it was better to control DO at 10%～20%than at 5%and 30%.We found that the concentration of pyruvate at the final time of fermentation was higher under low oxygen condition than that under high oxygen condition.Based on the results，a strategy of two stages for DO manipulation was proposed.With this strategy，the adenosine accumulated in 50L fermentor ultimately reached 20.1g/L.

Key wordsBacillus subtilis，fermentation，adenosine，dissolved oxygen

Effects of Dissolved Oxygen Control on Adenosine
Production of Bacillus subtilis in Fermentation

Liu Jian，Xu Da
(Star Lake Bioscience Co.Inc，Zhaoqing 526060，China)

學(xué)士，工程師。

2012-04-11，改回日期:2012-05-24