于雅娟，戴軍，朱松，陳尚衛(wèi)，江波

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

酸酶水解-HPLC法檢測香菇多糖中β-D-葡聚糖含量*

于雅娟，戴軍，朱松，陳尚衛(wèi)，江波

(江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

為了更有效地監(jiān)控食品和醫(yī)藥行業(yè)中香菇多糖制品的質(zhì)量，建立了一種香菇多糖中主要活性成分β-D-葡聚糖含量測定的新方法:香菇多糖樣品經(jīng)酸部分水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶進一步完全水解以測定總葡聚糖含量;另用淀粉葡萄糖苷酶水解樣品中α-葡聚糖;根據(jù)HPLC測定的總葡聚糖與α-葡聚糖含量之差計得β-D-葡聚糖含量。分別用該方法和苯酚硫酸法及剛果紅法測定已知含量的β-D-葡聚糖對照樣品的結(jié)果表明:該方法最接近于對照品標示值，且重復(fù)性好，可用作為香菇多糖產(chǎn)品中β-D-葡聚糖含量測定的專屬方法。

香菇多糖，β-D-葡聚糖，酸酶水解，HPLC

香菇多糖是一種以β-(1，3)-D葡萄糖殘基為主鏈，側(cè)鏈為β-(1，6)-D葡萄糖殘基的葡聚糖，其中每5個β-(1，3)-D-Glc就有2個β-(1，6)-D-Glc。香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等功能和幾乎無毒副作用的優(yōu)點已得到學術(shù)界的公認，并已經(jīng)作為一種輔助治療腫瘤的藥物應(yīng)用于臨床，或作為免疫增強劑用于保健食品中。藥理研究結(jié)果表明，香菇多糖的主要抗癌活性成分是β-D-葡聚糖[1-2］，其含量的高低是表征香菇多糖產(chǎn)品質(zhì)量的主要指標之一。然而目前食品或藥品企業(yè)使用的香菇多糖產(chǎn)品檢測方法是蒽酮比色法或苯酚硫酸法(NY/T 1676—2008，食用菌中粗多糖含量的測定，農(nóng)業(yè)行業(yè)標準)，主要檢測總多糖含量，沒有專屬性。關(guān)于香菇多糖中的β-D-葡聚糖的檢測方法尚無文獻報道。針對啤酒中β-D-葡聚糖的含量測定，文獻中大多采用剛果紅法[3］。

本文根據(jù)香菇多糖產(chǎn)品的組成特點，建立了一種香菇多糖產(chǎn)品中β-D-葡聚糖含量測定的新方法，即將香菇多糖部分酸水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶進一步完全水解用于測定香菇多糖中的總葡聚糖含量，用淀粉葡糖苷酶水解香菇多糖中的α-葡聚糖，根據(jù)HPLC測定的總葡聚糖含量與α-葡聚糖含量之差，計得β-D-葡聚糖含量;并以已知含量的β-D-葡聚糖對照品為樣品，分別用本方法和苯酚硫酸法及剛果紅法進行檢測和比較，以驗證3種方法的適用性。

1 實驗材料與試劑

1.1 儀器與試劑

Waters 600高效液相色譜儀，配2410示差折光檢測器;7200型分光光度計(美國UNICO尤尼柯限公司);D-葡萄糖(Glc，99%，國藥集團化學試劑有限公司);酵母β-葡聚糖對照品(純度53%，美國Sigma-Aldrich公司);昆布多糖對照品(純度30%，美國Sigma-Aldrich公司);熱凝膠多糖(Curdlan，純度99%，美國Sigma-Aldrich公司);β-(1，3)-葡聚糖外切酶(E.C.3.2.1.58，100000 U/L)，購于上海中西遠大科技有限公司;β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21，20，000 U/L)購于上海佳和生物科技有限公司;淀粉葡糖苷酶(EC 3.2.1.3，1，630，000 U/L)，購于南昌瑞洋科技發(fā)展有限公司。苯酚、硫酸、剛果紅等其他試劑均為分析純。

葡萄糖標準溶液:準確稱取2 g(精確至0.0001 g)經(jīng)過干燥至恒重的D-葡萄糖，用超純水定容于100 mL容量瓶中，配制成20 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

6%苯酚溶液:取苯酚100 g，鋁片0.01 g和NaHCO30.05 g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取上述處理過的苯酚5 g，加蒸餾水定容至100 mL。

剛果紅溶液:取25 mg剛果紅，加入0.2 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，定容至250 mL。

1.2 色譜條件

色譜柱:Spherisorb NH2色譜柱(0.46 cm×25 cm，7μm);流動相:乙腈/水(7/3，體積比);流速:1 mL/min;檢測器:示差折光檢測器。

2 實驗方法

2.1 酸酶法

2.1.1 葡聚糖完全水解

分別準確稱取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、熱凝膠多糖、昆布多糖3個β-D-葡聚糖對照樣品至具塞試管中，加入1.5 mL濃HCl(37%，v/v)，混勻。在30℃下水浴45 min。水浴期間每隔15 min渦旋混勻1次，以確保所有的β-葡聚糖溶解。稀釋HCl至1.3 mol/L，渦旋混勻，置于沸水浴中，反應(yīng)2 h。反應(yīng)完后將試管冷卻至室溫，加入2 mol/L KOH，直至pH 5.0。定量轉(zhuǎn)移管中的內(nèi)容物至100 mL容量瓶，用200 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液漂洗試管，并合并于容量瓶中，再定容、過濾。取0.1 mL濾液，加0.1 mL用200 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液稀釋的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，旋渦混勻，40℃反應(yīng)1 h，得到酶解液1。

2.1.2 酶解 α-葡聚糖

分別準確稱取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、熱凝膠多糖、昆布多糖3個β-D-葡聚糖對照樣品至具塞試管中，加入2 mL2mol/L的KOH，再將試管在冰浴狀態(tài)下磁力攪拌20 min。向試管中加8 mL的1.2 mol/L pH 3.8醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌以混勻溶液。立即加入0.2 mL溶于50%甘油的淀粉葡糖苷酶液，混勻，40℃下反應(yīng)30 min，期間間歇漩渦混勻。離心(1500 g)10 min，得到酶解液2。

2.1.3 HPLC測定酶解液中葡萄糖含量

將葡萄糖標準溶液及上述酶解液分別過0.22 μm的濾膜，按1.2進樣分析，以外標法測定葡萄糖含量，并按下列公式計算β-D-葡聚糖含量:

式中X1和X2分別為由酶解液1和酶解液2測得的葡萄糖含量。

2.2 苯酚硫酸法[4］

取葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL到10 mL具塞試管中，分別補水至1.0 mL，混合均勻，加入6%苯酚溶液1.0 mL，混勻，然后迅速垂直滴加5.0 mL H2SO4，立即漩渦混勻。在80℃下反應(yīng)30 min，靜置冷卻至室溫，于A490nm處測定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)對吸光值A(chǔ)作線性回歸，得標準曲線方程。

分別準確稱取適量香菇多糖樣品及3個β-D-葡聚糖對照品，控制糖含量在10～100 μg內(nèi)，同標準曲線測定法處理，測其吸光值，并由標準曲線方程計得樣品中葡萄糖含量，再計算樣品中總多糖含量:

式中，C為樣品溶液中葡萄糖的濃度(mg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W為相應(yīng)的樣品質(zhì)量(mg)。

2.3 剛果紅法[3］

2.3.1 標準曲線

由于沒有香菇多糖標準品，所以選用與香菇多糖結(jié)構(gòu)類似的curdlan[5］作為標準品。精密稱取10 mg curdlan，用0.5 mol/L NaOH溶解，用0.5 mol/L HCl中和至pH 8～9，再定容至100 mL，即得到0.1 mg/mL標準溶液。分別移取其標準溶液0，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL至10 mL具塞試管中，均補水至2.0 mL，混勻，加入pH 8.0的剛果紅溶液4.0 mL，搖勻，然后30℃反應(yīng)30 min，于550 nm處測定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)對吸光值A(chǔ)作線性回歸，即得標準曲線方程。

2.3.2 樣品中β-D-葡聚糖含量的測定

分別準確稱取一定量香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照樣品配制成1 mg/mL水溶液，精密吸取0.5 mL至10 mL具塞試管中，補水至2.0 mL，加入4.0 mL剛果紅溶液，混勻，30℃反應(yīng)30 min，于550 nm處測定其吸光值，并由標準曲線方程計得樣品中葡萄糖含量。計算樣品中β-D-葡聚糖含量:

式中，C為樣品溶液中葡聚糖的濃度(mg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W為相應(yīng)的樣品質(zhì)量(mg)。

3 結(jié)果與討論

3.1 酸酶水解-HPLC法測定原理

β-(1，3)-葡聚糖外切酶來源于木霉菌，該酶的最適反應(yīng)溫度為40～50℃;最適反應(yīng)pH在pH 6.0以下[7］。該酶的水解模式是與底物結(jié)合后從β-(1，3)-葡聚糖的非還原性末端開始依次切開底物的β-(1，3)-葡萄糖糖苷鍵，釋放單一的葡萄糖。β-葡萄糖苷酶，又稱β-D-葡萄糖苷，存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉及細菌體內(nèi)。它能夠催化水解結(jié)合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出D-葡萄糖[8］。淀粉葡糖苷酶，又稱為葡糖淀粉酶，能夠從1，4-α-D-葡聚糖鏈的非還原性末端依次催化水解1，4-α-D-葡糖苷鍵，釋放出α-D-葡萄糖。也能迅速水解與1，4-糖苷鍵鄰接的1，6-α-D-糖苷鍵。

本方法是先將香菇多糖進行部分酸水解，使β-D-葡聚糖降解和非凝膠化且切斷與蛋白或其它多糖的鍵合而溶于水，并使α-葡聚糖完全水解。再用β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶把較難酸解的β-葡聚糖完全水解成葡萄糖，然后通過測定釋放的葡萄糖的量計算香菇多糖中的葡聚糖總量。為計算β-D-葡聚糖的含量，需扣除可能含有的少量α-葡聚糖。本方法主要利用淀粉葡糖苷酶將α-葡聚糖水解成葡萄糖，再用HPLC測定之。

3.2 酸酶水解-HPLC法測定結(jié)果

用已知含量的昆布多糖，酵母β-葡聚糖對照品以及curdlan作為β-D-葡聚糖對照品，與香菇多糖樣品一起進行酸酶法測定，其中香菇多糖樣品的酶解液1和酶解液2的HPLC譜圖見圖1和圖2，其中保留時間6.32 min是葡萄糖峰。根據(jù)外標法計算的結(jié)果見表1。由表1可見，該方法測定結(jié)果與供試品標示含量很接近。平行樣品(n=3)測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為2.02%～2.94%，重復(fù)性很好。結(jié)果表明，該方法準確可靠，可以用于香菇多糖中β-D-葡聚糖含量的測定。

圖1 酶解液1的HPLC譜圖

圖2 酶解液2的HPLC譜圖

表1 酸酶水解-HPLC法測定香菇多糖樣品及對照品的β-D-葡聚糖含量(n=3)

3.3 苯酚硫酸法與酸酶法的結(jié)果比較

按2.2測得標準曲線的回歸方程為y=0.0090x-0.0020，R2=0.9978。在0～100 μg內(nèi)，糖含量與吸光值線性關(guān)系良好。

分別取2.0 mL經(jīng)稀釋好的香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照品，按2.2的方法測定吸光值，平行測定3次，取平均值，通過標準曲線，計算出樣品中多糖含量，結(jié)果如表2。

表2 苯酚硫酸法及剛果紅法測定香菇多糖樣品及對照品的葡聚糖含量(n=3)

苯酚硫酸法是多糖含量測定的常用方法，該法測定的是樣品中總糖含量，沒有選擇性，故除Curdlan外結(jié)果比酸酶法測定的β-D-葡聚糖含量高許多。其方法缺乏專屬性。

3.4 剛果紅法與酸酶法的結(jié)果比較

剛果紅與β-D-葡聚糖的結(jié)合具有高度專一性，在一定條件下能夠形成有色物質(zhì)[9］。剛果紅法多應(yīng)用于燕麥和啤酒中的β-葡聚糖的含量測定，所用標準品一般為從小麥中提取出的β-葡聚糖標準品。本文選用與香菇多糖結(jié)構(gòu)類似的Curdlan作為標準品，用與樣品溶解相同的方法配制標準溶液，定量測定香菇多糖及β-D-葡聚糖對照品中β-D-葡聚糖的含量。以葡萄糖含量(x)對吸光值(y)作線性回歸得標準曲線方程為y=0.0013x+0.0392，R2=0.9960。香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照品的測定結(jié)果于表2。與酸酶法比較，測定的結(jié)果過低，可能是因為對照品中β-D-葡聚糖分子被其他多糖或蛋白等大分子包裹未能充分溶解和絡(luò)合，使顯色不足，故該法不適用于測定固態(tài)供試品中β-D-葡聚糖含量。

4 結(jié)論

β-D-葡聚糖是香菇多糖中主要活性成分，其含量是表征香菇多糖產(chǎn)品質(zhì)量的主要指標之一。與苯酚硫酸法及剛果紅法比較，本文建立的酸酶水解-HPLC法對于香菇多糖中β-D-葡聚糖的含量測定具有較好專屬性，準確可靠，重復(fù)性好，可應(yīng)用于香菇多糖產(chǎn)品的質(zhì)量檢測和監(jiān)控。

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ABSTRACTA new method for determination of β-D-glucans content in Lentinan was developed by acidic and enzymatic hydrolysis coupled with high performance liquid chromatography(HPLC).Lentinan was hydrolyzed entirely to glucose with exo-1，3-β-glucanase and β-Glucosidase after partial acid hydrolysis for determination of total glucans by HPLC.α-Glucans in Lentinan samples were hydrolyzed to glucose with Amyloglucosidase and then also analyzed by HPLC.The content of β-D-glucan was calculated by the difference between total glucans and α-glucans.Moreover，the above method and phenol sulfuric acid method and Congo red method were used respectively to determine the content of glucans(or β-D-glucan)in laminarin，curdlan and yeast glucan samples whose β-D-glucan content were known.Compared the results from three methods，acidic and enzymatic hydrolysis coupled HPLC method were the most suitable for quantitative analysis of β-D-glucans in Lentinan.RSD of the method were 2.02%～2.94%.

Key wordsLentinan，β-D-glucan，acidic and enzymatic hydrolysis，HPLC

Detemination of β-D-glucan in Lentinan by Acidic and Enzymatic Hydrolysis Coupled HPLC

Yu Ya-juan，Dai Jun，Zhu Song，Chen Shang-wei，Jiang Bo
(Sate Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(戴軍教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金(31171688)

2012-04-10，改回日期:2012-06-07