常 蕓，楊紅霞

力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α的變化及其在運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生中的作用

常 蕓，楊紅霞

目的：探討力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心臟竇房結(jié)、房室結(jié)和浦肯野氏纖維細(xì)胞炎性因子TNF-α基因和蛋白水平的表達(dá)特點(diǎn)，為運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：100只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為一次和反復(fù)力竭組及相應(yīng)的對(duì)照組，每組10只。分別于力竭運(yùn)動(dòng)后0、4、12及24h應(yīng)用激光顯微切割技術(shù)定位并收集竇房結(jié)、房室結(jié)和浦肯野氏纖維細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光方法研究細(xì)胞炎性因子TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：一次力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)和房室結(jié)的TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)規(guī)律基本一致，呈先升高后下降的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后即刻明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。浦肯野纖維TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)呈先下降后上升趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后4h明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)、房室結(jié)和浦肯野纖維的TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，竇房結(jié)和浦肯野纖維在運(yùn)動(dòng)后12h最明顯，房室結(jié)在運(yùn)動(dòng)后24h最明顯（P＜0.01）。結(jié)論：一次力竭運(yùn)動(dòng)后即刻竇房結(jié)和房室結(jié)炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平均大量表達(dá)，易引起心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)增殖乃至纖維化和損傷，勢(shì)必影響正常心臟的起搏和傳導(dǎo)，構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理基礎(chǔ)。而反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)致心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位細(xì)胞累積損傷，作為細(xì)胞炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平未表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激性反應(yīng)，呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢(shì)。

力竭運(yùn)動(dòng)；腫瘤壞死因子α；竇房結(jié)；房室結(jié)；浦肯野氏纖維；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

運(yùn)動(dòng)性心律失常一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。而運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)生機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及眾多因子。運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界對(duì)此進(jìn)行了廣泛的臨床觀察與調(diào)研［3］。常蕓等針對(duì)運(yùn)動(dòng)性心律失常的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)性研究［1，2］。目前，運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生的可能原因仍未完全闡明，以往實(shí)驗(yàn)性研究方法大多數(shù)集中心肌組織，很難概括心律失常發(fā)生的病理機(jī)制。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)作為心電活動(dòng)的控制中心和沖動(dòng)傳導(dǎo)的重要部位，其特殊的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型決定其具有不同于普通心肌的心電起搏和傳導(dǎo)功能，與各種類型心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系，成為目前心臟研究領(lǐng)域十分關(guān)注的熱點(diǎn)。

研究表明，心肌細(xì)胞含有TNF-α受體，心臟既是TNF-α的合成場(chǎng)所又是發(fā)揮作用的靶器官。TNF-α的局部炎癥反應(yīng)和促凝固作用，使TNF-α在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌的代謝中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)直接損傷心肌纖維，使細(xì)胞間質(zhì)重新分布，發(fā)生毛細(xì)血管滲出和堵塞等病理過(guò)程，直接造成心肌收縮功能的降低。此外，TNF-α還可直接或間接來(lái)影響心肌能量代謝和肌細(xì)胞膜上離子通道的功能，并通過(guò)NO通道誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。因此，TNF-α是急性心肌梗死、慢性心力衰竭、病毒性心肌炎發(fā)生的重要介質(zhì)；在缺血再灌注損傷、心肌循環(huán)功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡中也起著重要的作用。研究認(rèn)為，TNF-α是衡量心肌損傷的敏感指標(biāo)。為此，本研究擬對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α的變化進(jìn)行研究，觀察力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的TNF-α在mRNA和蛋白水平的表達(dá)規(guī)律及其在運(yùn)動(dòng)性心肌損傷和心律失常發(fā)生中的作用，試圖為運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生機(jī)制的探討提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康雄性成年SD大鼠100只，8周齡，體重220±8 g。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20℃±2℃，光照時(shí)間12h，相對(duì)濕度40%～55%。

1.2 運(yùn)動(dòng)負(fù)荷

將100只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為10組，每組10只。其中，一次力竭和2周反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)［11］各4組，相應(yīng)安靜對(duì)照2組。安靜對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠尾部負(fù)重為體重的3%，反復(fù)運(yùn)動(dòng)組每周運(yùn)動(dòng)6天，每天1次。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas的報(bào)道［16］，即“經(jīng)過(guò)10s后動(dòng)物仍不能返回水面，并且撈出后置于平面不能完成翻正反射”。1.3 取材

最后一次力竭運(yùn)動(dòng)后即刻、4h、12h及24h等不同時(shí)相取材，迅速取出心臟，沿心臟矢狀面的方向?qū)⒄麄€(gè)心臟用OCT包埋，液氮驟冷，作全心連續(xù)冰凍切片，光鏡定位心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，運(yùn)用激光顯微切割儀切割分別收集心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用Trizol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，存于－20℃?zhèn)溆?。通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找目標(biāo)因子TNF-α和內(nèi)參照β-actin的引物基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物擴(kuò)增目標(biāo)基因片斷長(zhǎng)度均小于150bp，其PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證引物可用后，再進(jìn)行熒光定量PCR，取定量PCR用96孔板，加入cDNA和引物配置25μL反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)定量RT-PCR主要過(guò)程：預(yù)變性95℃30s，PCR反應(yīng)95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)CT值。利用SDS 2.2軟件對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并導(dǎo)出文件及圖像。利用管家基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進(jìn)行校正，得到相對(duì)定量結(jié)果（相對(duì)數(shù)值）。設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)冰凍切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，采用Leica AD MDW活細(xì)胞多維圖成像工作站和Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)因子蛋白熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，熒光強(qiáng)度用積分灰度表示（IOD），參考陰性對(duì)照標(biāo)本中熒光強(qiáng)度，灰度值在40～130之間為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用多因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)

經(jīng)過(guò)兩種力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠不同程度出現(xiàn)心律失常，心臟肉眼觀察有不同程度的充血，且反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)后各時(shí)相組心臟重量指數(shù)均顯著高于對(duì)照組心臟重量指數(shù)（P＜0.05），一次力竭運(yùn)動(dòng)后和反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后實(shí)驗(yàn)大鼠有不同程度的心律失常，具體數(shù)據(jù)結(jié)果參見參考文獻(xiàn)［4］。

2.2 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-αmRNA表達(dá)結(jié)果

2.2.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-αmRNA表達(dá)特點(diǎn)

如表2所示，經(jīng)一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)后4h心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)顯著高于12h（P＜0.01）；即刻房室結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組和其他各運(yùn)動(dòng)組（P＜0.01）；4h、12h浦肯野氏纖維TNF-αmRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），4h又顯著低于即刻（P＜0.05）。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)后存有差異，其中，即刻，浦肯野氏纖維顯著高于房室結(jié)（P＜0.01）；4h，浦肯野氏纖維顯著低于竇房結(jié)和房室結(jié)（P＜0.01）；24h，浦肯野氏纖維顯著高于竇房結(jié)（P＜0.05）。其他時(shí)相心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位差異不明顯（P＞0.05）。

總體來(lái)看，一次力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)和房室結(jié)的TNF-α mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致，呈先升高后下降的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后即刻明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。浦肯野纖維呈先下降后上升的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后4h下降最明顯（P＜0.05，圖1）。

圖1 本研究一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量曲線圖Figure 1. The mRNA Expression of TNF-α in One-time Exhaustive Swimming Group

2.2.2 反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-αmRNA表達(dá)特點(diǎn)

如表3所示，經(jīng)反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、浦肯野氏纖維TNF-αmRNA表達(dá)各時(shí)相組間差異不明顯（P＞0.05）；12h、24h房室結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)均顯著低于對(duì)照組和其他各運(yùn)動(dòng)組（P＜0.01），即刻又顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)后存有差異，其中，即刻，房室結(jié)顯著高于浦肯野氏纖維（P＜0.01）；4h和12h，房室結(jié)顯著高于竇房結(jié)（P＜0.01）和浦肯野氏纖維（P＜0.05）。其他時(shí)相心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位差異不明顯（P＞0.05）。

總體來(lái)看，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位TNF-α mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致，呈下降趨勢(shì)，竇房結(jié)和浦肯野氏纖維TNF-αmRNA表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后12h下降接近低谷，房室結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后24h下降至低谷（圖2）。

2.2.3 不同力竭方式運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-αmRNA表達(dá)特點(diǎn)

如表2、表3、圖3所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、4h顯著低于一次力竭后即刻（P＜0.05）和4h（P＜0.01），其他時(shí)相組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

如表2、表3、圖4所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)房室結(jié)TNF-αmRNA表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、24h顯著低于一次力竭后即刻（P＜0.01）、24h（P＜0.05），其他時(shí)相組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

如表2、表3、圖5所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)浦肯野氏纖維TNF-αmRNA表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、24h顯著低于一次力竭后即刻（P＜0.05）和24h（P＜0.05），其他時(shí)相組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表3 本研究反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量一覽表Table 3 The mRNA Expression of TNF-αin Repeated Exhaustive Swimming Group

2.3 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3.1 一次力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α蛋白表達(dá)特點(diǎn)

力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α免疫熒光染色結(jié)果。如表4所示，經(jīng)一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)即刻顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），4h、12h、24h又均顯著低于對(duì)照組和即刻（P＜0.01），其中竇房結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)12h顯著低于4 h和24h（P＜0.01），房室結(jié)12h顯著高于24h。

浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)后各組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），4h、12h、24h又顯著低于即刻（P＜0.01），且24h顯著高于4h和12h（P＜0.01）。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)后存有差異。其中，即刻和24h，浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)顯著高于竇房結(jié)和房室結(jié)（P＜0.01）；12h，竇房結(jié)顯著低于房室結(jié)和浦肯野氏纖維（P＜0.01）。

總體來(lái)看，一次力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)和房室結(jié)的TNF-α蛋白表達(dá)規(guī)律基本一致，呈先升高后下降的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后即刻明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。浦肯野纖維呈先下降后上升的趨勢(shì)，在運(yùn)動(dòng)后4h下降最明顯（P＜0.05；圖6）。

圖6 本研究一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況曲線圖Figure 6. The Protein Expression of TNF-α in One-time Exhaustive Swimming Group

2.3.2 反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α蛋白表達(dá)特點(diǎn)

如表5所示，經(jīng)反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)即刻顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），4h、12h、24h又均顯著低于即刻（P＜0.01）。

房室結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)12h顯著低于對(duì)照組、即刻和4h（P＜0.01），24h顯著低于對(duì)照組、即刻、4h（P＜0.01）和12h（P＜0.05）。

浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)后各組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），12h又顯著低于即刻（P＜0.01）。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位在反復(fù)力竭游泳運(yùn)動(dòng)后存有差異。其中，即刻，竇房結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)顯著高于房室結(jié)（P＜0.05）和浦肯野氏纖維（P＜0.01）；4h和12h，房室結(jié)顯著高于竇房結(jié)和浦肯野氏纖維（P＜0.05）；24h，浦肯野氏纖維顯著高于竇房結(jié)和房室結(jié)（P＜0.01）。

表4 本研究一次力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況一覽表Table 4 The Protein Expression of TNF-αin One-time Exhaustive Swimming Group

表5 本研究反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況一覽表Table 5 The Protein Expression of TNF-αin Repeated Exhaustive Swimming Group

總體來(lái)看，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位TNF-α蛋白表達(dá)規(guī)律基本一致，呈下降趨勢(shì)。其中，竇房結(jié)和浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后12h下降接近低谷，房室結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后24h下降至低谷（圖7）。

圖7 本研究反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況曲線圖Figure 7. The Protein Expression of TNF-α in Repeated Exhaustive Swimming Group

2.3.3 不同力竭方式運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α蛋白表達(dá)特點(diǎn)

如表4、表5、圖8所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、4h、24h均顯著低于一次力竭后即刻、4h、24h（P＜0.01）。

圖8 本研究?jī)煞N不同力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠竇房結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況曲線圖Figure 8. The Protein Expression of TNF-α on SAN in Two Exhaustive Swimming Group

如表4、表5、圖9所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)房室結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、12h、24h均顯著低于一次力竭后即刻、12h、24h（P＜0.01），反復(fù)力竭后4h顯著高于一次力竭后4h（P＜0.05）。

圖9 本研究?jī)煞N不同力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠房室結(jié)TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況曲線圖Figure 9. The Protein Expression of TNF-α on AVN in Two Exhaustive Swimming Group

如表4、表5、圖10所示，兩種不同方式力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)在反復(fù)力竭后即刻、4h、12h和24h均顯著低于一次力竭后即刻、4h、12h和24h（P＜0.01）。

圖10 本研究?jī)煞N不同力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠浦肯野氏纖維TNF-α蛋白表達(dá)總灰度值變化情況曲線圖Figure 10. The Protein Expression of TNF-αon Purkinje’s Fiber in Two Exhaustive Swimming Group

3 討論

近年研究表明，TNF-α是急性心肌梗死、慢性心力衰竭、病毒性心肌炎和運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的重要介質(zhì)；在缺血再灌注損傷、心肌循環(huán)功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡中也起著重要的作用，認(rèn)為是衡量心肌損傷的敏感指標(biāo)。Hedayat M等［5，6］在心力衰竭患者的血漿中發(fā)現(xiàn)TNF-α的高表達(dá)。隨后的研究［7，13］也發(fā)現(xiàn)，慢性心衰患者中TNF-α，水平比對(duì)照組顯著增高，并且TNF-α的濃度水平反應(yīng)心衰的嚴(yán)重程度。心肌細(xì)胞含有TNF-α受體，心臟既是TNF-α的合成場(chǎng)所又是發(fā)揮作用的靶器官。TNF-α的局部炎癥反應(yīng)和促凝固作用，使TNF-α在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌的代謝中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)直接損傷心肌纖維，使細(xì)胞間質(zhì)分裂、重新分布，毛細(xì)血管液體滲出和毛細(xì)血管堵塞等病理過(guò)程，直接造成心肌收縮功能的降低。此外，TNF-α還可直接或間接來(lái)影響心肌能量代謝和肌細(xì)胞膜上離子通道的功能，并通過(guò)NO通道引起心肌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞凋亡數(shù)量與TNF-α濃度成正比［12］。TNF-α來(lái)源于體內(nèi)多種細(xì)胞，脂多糖（LPS）、病毒、真菌、過(guò)敏毒素、IL-1和免疫復(fù)合物等均可刺激其分泌，由157個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為17000的可溶性多肽。研究發(fā)現(xiàn)［10］，成熟的心肌細(xì)胞在某些應(yīng)激狀態(tài)下具有產(chǎn)生TNF-αmRNA及其蛋白質(zhì)的能力，并可直接影響心臟結(jié)構(gòu)和功能，并參與多種心臟病的病理過(guò)程。本研究從大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的炎性因子TNF-α的表達(dá)變化入手，試圖為運(yùn)動(dòng)性心律失常發(fā)生機(jī)制的闡明及其運(yùn)動(dòng)員心臟問(wèn)題的醫(yī)務(wù)監(jiān)督提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)后和反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后引起部分實(shí)驗(yàn)大鼠心律失常，證實(shí)本研究建立運(yùn)動(dòng)性心律失常的模型成功［4］。且研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析認(rèn)為，一次力竭運(yùn)動(dòng)后TNF-α升高，可激活淋巴細(xì)胞增殖分裂、活化巨細(xì)胞、趨化各種炎性細(xì)胞，釋放炎性因子引起竇房結(jié)細(xì)胞出現(xiàn)各種炎性反應(yīng)［9，14］。隨運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，炎性反應(yīng)逐漸減弱。由于反復(fù)力竭刺激作用，直接引起竇房結(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，導(dǎo)致TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)相對(duì)下降或者不表達(dá)。提示，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后竇房結(jié)細(xì)胞受多種因素影響，累積損傷程度更重［8，15］，作為細(xì)胞炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平未表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激性反應(yīng)，呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)后房室結(jié)TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且運(yùn)動(dòng)后即刻顯著高于對(duì)照組和其他各運(yùn)動(dòng)組。一次力竭運(yùn)動(dòng)后TNF-α升高，可激活各種炎性細(xì)胞，釋放炎性因子引起房室結(jié)細(xì)胞出現(xiàn)各種炎性反應(yīng)，進(jìn)而引起房室結(jié)細(xì)胞損傷。隨運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，炎性反應(yīng)逐漸減弱。反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后呈下降趨勢(shì)，且運(yùn)動(dòng)后12h、24h均顯著低于對(duì)照組和其他各運(yùn)動(dòng)組。由于反復(fù)力竭的刺激，房室結(jié)細(xì)胞損傷加劇，引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，出現(xiàn)TNF-α表達(dá)相對(duì)下降的趨勢(shì)，且反復(fù)力竭后即刻和24h顯著低于一次力竭后即刻和24h。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)浦肯野氏纖維TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)呈先下降后上升的趨勢(shì)，且運(yùn)動(dòng)后4h、12h浦肯野氏纖維TNF-αmRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組。提示，力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位的改變不僅存在差異，且有時(shí)相性改變，TNF-α在運(yùn)動(dòng)后即刻表達(dá)相對(duì)下降或者表達(dá)缺失，隨恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α出現(xiàn)異常高表達(dá)，這一改變可激活淋巴細(xì)胞增殖分裂、巨噬細(xì)胞活化，趨化各種炎性細(xì)胞，釋放炎性因子引起浦肯野氏纖維出現(xiàn)各種炎性反應(yīng)，從而影響心室內(nèi)的興奮性傳導(dǎo)，引發(fā)室性心律失常。而反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)后TNF-α表達(dá)呈下降趨勢(shì)，一直持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后24h，且各時(shí)相組間差異不明顯，作為細(xì)胞炎性因子TNF-α在浦肯野氏纖維mRNA和蛋白水平也未表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激性反應(yīng)，這一點(diǎn)與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)其他部位的改變基本一致。

總之，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻竇房結(jié)和房室結(jié)炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平均大量表達(dá)，易引起心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)增殖乃至纖維化和損傷，勢(shì)必影響正常心臟的起搏和傳導(dǎo)，構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

1.力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)TNF-α在mRNA和蛋白水平表達(dá)規(guī)律基本一致，其中，一次力竭運(yùn)動(dòng)后即刻竇房結(jié)和房室結(jié)炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平均大量表達(dá)，易引起心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)增殖乃至纖維化和損傷的發(fā)生，其結(jié)果勢(shì)必影響正常心臟的起搏和傳導(dǎo)，構(gòu)成運(yùn)動(dòng)性心律失常的病理基礎(chǔ)。而反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)致心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)各部位細(xì)胞累積損傷，作為細(xì)胞炎性因子TNF-α在mRNA和蛋白水平均未表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激性反應(yīng)，呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢(shì)。

2.力竭運(yùn)動(dòng)后心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)不同部位的改變不僅存在差異，且有時(shí)相性改變，尤其表現(xiàn)在心臟浦肯野氏纖維滯后的異常高表達(dá)，又激活該部位淋巴細(xì)胞增殖分裂、巨噬細(xì)胞活化、趨化各種炎性細(xì)胞，釋放炎性反應(yīng)因子引起浦肯野氏纖維出現(xiàn)各種炎性反應(yīng)，將影響心室內(nèi)的興奮性傳導(dǎo)，構(gòu)成室性心律失常的誘發(fā)因素。

［1］常蕓.運(yùn)動(dòng)心臟理論與實(shí)踐［M］.北京：人民體育出版社，2008：106-132.

［2］常蕓.運(yùn)動(dòng)員心臟的醫(yī)務(wù)監(jiān)督［M］.北京：北京體育大學(xué)出版社，2009：203-207.

［3］曲綿域.實(shí)用運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)［M］.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，1996：311-318.

［4］楊紅霞，常蕓.力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心臟竇房結(jié)ADAMTS-1的變化［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，30（5）：437-441.

［5］DUNLAY S M，WESTON S A，REDFIELD M M，et al.Tumor necrosis factor-alpha and mortality in heart failure：a community study［J］.Circulation，2008，118（6）：625-631.

［6］HEDAYAT M，MAHMOUDI M J，ROSE N R，et al.Proinflammatory cytokines in heart failure：double-edged swords［J］.Heart Fail Rev，2010，15（6）：543-562.

［7］HOHENSINNER P J，NIESSNER A，HUBER K，et al.Inflammation and cardiac outcome［J］.Curr Opin Infect Dis，2011，24（3）：259-264.

［8］HUANG C C，LIN T J，CHEN C C，et al.Endurance training accelerates exhaustive exercise-induced mitochondrial DNA deletion and apoptosis of left ventricle myocardium in rats［J］.Eur J Appl Physiol，2009，107（6）：697-706.

［9］JOBE L J，MELENDEZ G C，LEVICK S P，et al.TNF-alpha inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（4）：H1462-H1468.

［10］KLEINBONGARD P，SCHULZ R，HEUSCH G.TNFalpha in myocardial ischemia／reperfusion，remodeling and heart failure［J］.Heart Fail Rev，2011，16（1）：49-69.

［11］KRAMER K，DIJKSTRA H，BAST A.Control of physical exercise of rats in a swimming basin［J］.Physiol Behav，1993，53（2）：271-276.

［12］LI S，JIAO X，TAO L，et al.Tumor necrosis factor-alpha in mechanic trauma plasma mediates cardiomyocyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（3）：H1847-H1852.

［13］MARTINEZ，ROSAS M.Cardiac remodeling and inflammation［J］.Arch Cardiol Mex，2006，76Suppl 4：S58-S66.

［14］SUZUKI K，NAKAJI S，YAMADA M，et al.Systemic inflammatory response to exhaustive exercise.Cytokine Kinetics［J］.Exerc Immunol Rev，2002，8：6-48.

［15］TANAKA Y，KAWANISHI N，SHIVA D，et al.Exhaustive exercise reduces tumor necrosis factor-alpha production in response to lipopolysaccharide in mice［J］.Neuroimmunomodulation，2010，17（4）：279-286.

［16］THOMAS D P，MARSHALL K I.Effect of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures［J］.Int J Sports Med，1988，9（4）：257-260.

The Expression of TNF-αin Cardiac Conduction System after Exhaustive Exercise and Their Role in Exercise Induced Arrhythmia

CHANG Yun，YANG Hong-xia

Objective：To discuss the gene and protein expression characters of TNF-αof cardiac sinus node，atrioventricular node and Purkinje fibers at different time-phrase after exhaustive exercise，providing experimental evidence for clarifying the mechanism of exercise-induced arrhythmia.Method：100healthy adult male SD rats were grouped into 10groups（10rats for each group）as 4groups of one-time exhaustive swimming group（n＝40），4groups of 2-week repeated exhaustive swimming group（n＝40）and 2control groups（n＝20）.Rats were sacrificed at 0，4，12，and 24hours after exhaustive swimming，then Laser microdissection（LMD）and immune fluorescent histochemical were underwent according to time-phrase.The SAN，AVN and Purkinje＇s fiber cells were spotted and collected in the approach of Laser Microdissection（LMD）.The mRNA and protein expression of TNF-αon the SAN，AVN and Purkinje＇s fiber cells were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR，immunochemistry and image analysis.Results：Compared to control group，the expression of mRNA and protein of TNF-αon cardiac sinoatrial node and atrioventricular node increased greatly immediately after two exhaustive exercise（P＜0.01）.The expression of mRNA and protein of TNF-αon cardiac Purkinje fiber dropped markedly 4hours after one-time exhaustive exercise（P＜0.01）.The expression of mRNA and protein of TNF-αon heart conduction system declined significantly after repeated exhaustive exercise，especially at 12hours after exercise on sinoatrial node and atrioventricular node and 24hours on Purkinje＇s fiber cells（P＜0.01）.Conclusion：After onetime exhaustive exercise，the mRNA and protein of TNF-αgreatly expressed on sinoatrial node and atrioventricular node，causes inflammation and proliferation on fiber cells，leading to the cardiac sinus pacing and sinus electrical conduction abnormalities，which is one of the factors of arrhythmia.Repeated exhaustive exercise causes irreversible damage on cardiac conduction system，and the mRNA and protein of TNF-αon heart conduction system expressed at low level and no significant change has tested.

exhaustiveswimming；TNF-α；cardiacsinoatrialnode；atrioventricularnode；Purkinje＇sfiber；rat；animalexperiment

G804.5

A

1000-677X（2012）07-0032-07

2012-03-08；

2012-06-18

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（基本10-01）。

常蕓（1957-），女，研究員，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)員心臟病生理與醫(yī)學(xué)監(jiān)督，Tel：（010）87182526，E-mail：changyun＠ciss.cn。

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京100061

China Institute of Sport Science，Beijing 100061，China.