林世鋒，王仁剛，王 軼，張吉順，任學(xué)良

貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽市金陽新區(qū)云潭北路 550081

煙草是世界上廣泛種植的葉用經(jīng)濟作物，煙葉的香氣是衡量其品質(zhì)和可用性的核心內(nèi)容和重要指標(biāo)之一，煙草品質(zhì)的優(yōu)劣很大程度上取決于煙葉的香味品質(zhì)［1-2］。類胡蘿卜素是影響煙葉香味品質(zhì)的主要成分之一，它不僅決定了調(diào)制后煙葉的顏色，其相關(guān)降解產(chǎn)物與煙葉的香氣質(zhì)和香氣量也有密切關(guān)系［3-4］。因此，對煙葉類胡蘿卜素及相關(guān)影響因素的研究一直是國內(nèi)外煙草業(yè)的熱點之一［5-7］。β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）是植物類胡蘿卜素合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它在植物葉黃素的生物合成中催化了β-胡蘿卜素經(jīng)中間產(chǎn)物β-隱黃素合成玉米黃素的過程［8］。許多植物如擬南芥［9］、辣椒［10］中已成功地分離出該基因，但在煙草中尚未見分離該基因的相關(guān)報道。煙草與辣椒同屬茄科植物，物種間同源基因序列相對保守，以此為切入點，以辣椒BCH基因cDNA序列為探針，通過電子克隆方法獲得1個煙草BCH基因并進行RT-PCR驗證和生物信息學(xué)分析，旨在為煙草類胡蘿卜素合成的調(diào)控和煙草BCH基因功能的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因的電子克隆

以辣椒β-胡蘿卜素羥化酶基因的全長cDNA序列（GenBank 登錄號：Y09225）［10］為信息探針，對 GenBank中EST_others數(shù)據(jù)庫指定物種煙草（Nicotiana tabacum）進行BLAST檢索，將檢索到的來自于煙草栽培品種K326的全部EST序列利用DNAMAN 6.0軟件進行拼接，形成重疊群（contig）。然后以此重疊群再次進行同源檢索、拼接，重復(fù)以上過程直至沒有更多煙草栽培品種K326的重疊EST檢出，最終獲得煙草栽培品種K326的β-胡蘿卜素羥化酶cDNA序列片段。再以此片段在GenBank中進行BlastX同源搜索，與其他物種的β-胡蘿卜素羥化酶同源蛋白進行序列比對，進而判斷拼接得到的煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因cDNA的正確性以及其ORF序列的完整性。

1.2 煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因的克隆

1.2.1 供試材料

煙草栽培品種K326在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，取培養(yǎng)30 d的煙苗葉片為試驗材料；宿主菌E.coli DH5α由本實驗室培養(yǎng)；質(zhì)粒pMD18-T Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品。

總RNA抽提所用的試劑盒RNeasy Plant Mini Kit購自Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000和DNA凝膠回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2.2 煙草葉片RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

煙草葉片總RNA的提取按照RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，German）說明書操作。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行。

1.2.3 引物設(shè)計與合成

以電子克隆所得到的完整cDNA ORF（編碼309個氨基酸殘基）序列為依據(jù)，設(shè)計合成特異引物，P1：5′-CTCTCTATCTCTCTCTCTCTCTCAACGC-3′；P2：5′-AG AGAGCCAGAGGACATTCAATTATTAGC-3′。特異引物由上海生工生物公司合成。

1.2.4 PCR擴增煙草BCH基因片段

用所設(shè)計的特異引物，以供試煙草cDNA為模板擴增特異片段。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性0.5 min，53℃復(fù)性0.5 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后取5 μL的PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 重組測序質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆和DNA序列測定

PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后與載體pMD18-T Vector（摩爾比3∶1）連接，4℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在X-gal/IPTG Amp平板上挑選白色克隆，由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成DNA序列測定。

1.3 煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的ORF finder軟件對開放閱讀框進行分析并翻譯成蛋白質(zhì)，通過BlastP程序進行序列相似性分析和氨基酸保守性預(yù)測；運用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列的多重比對；利用瑞士生物信息研究所網(wǎng)站（http://www.expasy.org/tools/）提 供 的 ProtParam，NetPhos，TMHMM 和SOPMA軟件進行蛋白的基本特性、磷酸化位點、跨膜性和二級結(jié)構(gòu)進行分析和預(yù)測；運用DNAMAN 6.0，ClustalX 2.0和MEGA3.1軟件進行蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對和進化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因的電子克隆

利用已知的辣椒β-胡蘿卜素羥化酶基因的核苷酸序列對GenBank中煙草EST數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索分析，發(fā)現(xiàn)7條相似性高的EST序列來自煙草品種K326，通過DNAMAN 6.0軟件將它們進行重疊群的裝配后，獲得contig成分及各個序列的拼接位置，如圖1所示。在組成的contig中，各條EST序列的拼接順序為：EB450833，EB440086，EB449504，EB439198，F(xiàn)G643733，DW001435，EB682815。通過拼接獲得一條長度為1215 bp的一致性序列，見圖1。

2.2 煙草β-胡蘿卜素羥化酶基因的RT-PCR驗證

通過對煙草EST數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索及反復(fù)拼接，最終獲得長度為1215 bp的煙草BCH基因的cDNA序列，經(jīng)NCBI ORF finder分析，該基因包括一個長度930 bp的開放閱讀框，編碼309個氨基酸殘基，所編碼的蛋白質(zhì)在150～269氨基酸處存在1個典型的FA_hydroxylase superfamily（脂肪酸羥化酶超家族）保守結(jié)構(gòu)域。將該基因命名為NtBCH1。采用RT-PCR的方法對上述結(jié)果進行了驗證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果出現(xiàn)單一條帶，約1.2 kb，與預(yù)計大小相符，見圖2。用pMD18-T Vector克隆后測序，結(jié)果與電子克隆序列一致，見圖3。該基因的序列已在GenBank注冊，登錄號為JQ410446。

圖2 煙草BCH1 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Identification of the RT-PCR productions of Nicotiana tabacum BCH1 cDNA by agrose gel electrophoresis

2.3 NtBCH1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ProtParam軟件對NtBCH1的氨基酸序列進行基本特性分析，結(jié)果顯示，NtBCH1蛋白的分子式為C1586H2431N423O428S14，分 子 量為 34721.1 Da，理論 等 電點pI 8.68。該蛋白含Leu（L）最多，占9.4%；其次為Ala（A），占8.4%；Glu（E）與Gly（G）數(shù)量相同，均占8.1%?？偟膸д姎埢ˋrg+Lys）為33，負電殘基（Asp+Glu）為30?？偟挠H水性平均系數(shù)為0.003，預(yù)測該蛋白屬于疏水性蛋白。該蛋白預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為50.87，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.4 煙草BCH1蛋白質(zhì)的磷酸化位點

圖3 煙草BCH1的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of Nicotiana tabacum BCH1

通過對NtBCH1中絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶的磷酸化位點進行在線分析（圖4），發(fā)現(xiàn)NtBCH1含有10個絲氨酸激酶磷酸化位點（第7，10，44，49，88，101，150，269，306和309位氨基酸）和1個蘇氨酸激酶磷酸化位點（第16位氨基酸），不含有酪氨酸激酶磷酸化位點。說明磷酸化位點修飾對BCH蛋白的功能可能非常重要，也可能是這些磷酸化作用參與BCH蛋白活性的調(diào)控。

2.5 煙草BCH1蛋白質(zhì)的跨膜性

圖4 NtBCH1的絲氨酸、蘇氨酸與酪氨酸激酶的磷酸化位點Fig.4 The prediction of phosphorylation site of serine,threonine and tyrosine kinase in NtBCH1

采用TMHMM對煙草β-胡蘿卜素羥化酶蛋白的跨膜性區(qū)域（transmembrane helices，TM helices）進行預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。TMHMM預(yù)測出NtBCH1存在4個跨膜區(qū)域，分別是：104aa-126aa，141aa-163aa，194aa-211aa，215aa-237aa。膜內(nèi)區(qū)域有 3個，分別是：laa-103aa，164aa-193aa，238aa-309aa。膜外區(qū)域有2個，分別是：127aa-140aa，212aa-214aa。

圖5 NtBCH1跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果Fig.5 Prediction of transmembrane helices for NtBCH1

2.6 NtBCH1蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運用SOPMA軟件分析NtBCH1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖6所示，α-螺旋約占46.28%，延伸直鏈約占14.89%，β-轉(zhuǎn)角約占6.80%，無規(guī)則卷曲約占32.04%，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

2.7 不同物種間β-胡蘿卜素羥化酶蛋白同源性比較

通過 NCBI網(wǎng)站的BLAST比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因的氨基酸序列與β-胡蘿卜素羥化酶蛋白有非常高的相似度。其中與番茄BCH蛋白（Solanum lycopersicum，NP_001234348）一致性最高，達84%；其次與辣椒BCH蛋白（Capsicum annuum，BCH2_CAPAN）的一致性為 83%（圖7）。

圖6 NtBCH1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.6 Secondary structure prediction of NtBCH1

圖7 不同植物BCH基因氨基酸序列同源性比較Fig.7 Alignment of deduced amino acid sequences of BCH genes of different plants

用Mega 3.1軟件將推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中的其他植物的16個β-胡蘿卜素羥化酶基因的氨基酸序列進行聚類分析，結(jié)果表明，在同科植物番茄、辣椒中均存在多種BCH基因（圖8），因此煙草中也可能存在不同編碼基因。本試驗只得到其中的1個基因，其他的基因還有待進一步研究。

3 結(jié)論與討論

圖8 煙草BCH1基因氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的聚類分析Fig.8 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of tobacco BCH1 gene with other reported genes

電子克隆（In silico cloning）是近年來伴隨著基因組計劃和EST計劃而發(fā)展起來的基因克隆新方法［11］，它依賴于各種生物信息數(shù)據(jù)庫，利用生物軟件拼接延伸EST序列，獲得目的基因的部分乃至全長的cDNA序列。本研究以辣椒BCH基因cDNA序列作為探針，對煙草EST數(shù)據(jù)庫進行檢索拼接，成功克隆到1個煙草BCH基因。在電子克隆檢索過程中，目標(biāo)物種鎖定煙草（Nicotiana tabacum），全部EST序列來源于同一品種K326，避免了品種間基因多態(tài)性造成序列拼接工作的復(fù)雜性，進而提高了電子克隆的準(zhǔn)確性。

到目前為止，BCH基因已從擬南芥、玉米、龍膽、福壽草和水仙花等植物中分離出來，其cDNA長1.1～1.5 kb，編碼308～320個氨基酸，分子量為34.36～35.55 kD，理論等電點為8.81～9.81，含有最豐富的氨基酸包括Ala，Leu和Gly。BCH編碼的氨基酸序列中都含有3～4個跨膜結(jié)構(gòu)域，1個功能結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要構(gòu)件［12］。對煙草栽培品種K326 BCH基因編碼的309個氨基酸序列分析中也發(fā)現(xiàn)了這些序列特征。此外，已有文獻報道β-胡蘿卜素羥化酶含10個保守組氨酸,它們形成兩組“HXXXXH”+“HXXHH”模體，在催化過程中起著十分重要的電子傳遞作用。缺少或改變其中1個保守組氨酸,也會大大降低酶的活性［10,13］。本試驗結(jié)果煙草β-胡蘿卜素羥化酶中同樣含有這樣兩組組氨酸模體，這充分說明了所得序列確實為β-胡蘿卜素羥化酶基因。

總之，從煙草栽培品種K326中克隆到了1個β-胡蘿卜素羥化酶基因，通過生物信息學(xué)技術(shù)對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域、功能結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu)等重要參數(shù)進行了預(yù)測與分析，并推測了與其他物種的生物進化關(guān)系。但對該基因的功能分析以及在煙草類胡蘿卜素合成調(diào)控中的具體作用尚有待進一步研究。

［1］周昆,周清明,胡曉蘭.烤煙香氣物質(zhì)研究進展［J］.中國煙草科學(xué),2008，29（2）：58-61.

［2］李軍萍.影響烤煙香氣物質(zhì)綜合因素的研究進展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（12）：56-59.

［3］李雪震,張希杰,李念勝,等.烤煙煙葉色素與煙葉品質(zhì)的關(guān)系［J］.中國煙草，1988（2）：23-27.

［4］姚益群,謝金倫,郭其菲,等.云南煙草香氣研究［J］.煙草科技，1998（4）：24-27.

［5］劉百戰(zhàn),冼可法.不同部位、成熟度及顏色的云南烤煙中某些中性香味成分的分析研究［J］.中國煙草學(xué)報,1993（3）：46-53.

［6］周正紅.煙草中化學(xué)成分對卷煙色香味品質(zhì)影響及其研究進展［J］.煙草科技,1997（2）：22-25.

［7］宮長榮,趙銘欽,汪耀富,等.不同烘烤條件下煙葉色素降解規(guī)律的研究［J］.煙草科技,1997（2）：33-34.

［8］Tian L,DellaPenna D.Progress in understanding the origin and functionsofcarotenoid hydroxylasesin plants ［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics,2004,430（1）：22-29.

［9］Sun Z,Gantt E,Cunningham F X Jr.Cloning and functional analysis ofthe beta-carotene hydroxylase ofArabidopsis thaliana［J］.The Journal of Biological Chemistry,1996,271（40）：24349-24352.

［10］BouvierF,Keller Y,d'Harlingue A,etal.Xanthophyll biosynthesis:molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.)［J］.Biochimica et Biophysica Acta,1998，1391（3）：320-328.

［11］Gill R W,Sanseau P.Rapid in silico cloning of genes using expressed sequence tags(ESTs)［J］.Biotechnology Annual Review，2000，5：25-44.

［12］趙大球,曹春燕,孔芬,等.植物β-胡蘿卜素羥化酶的生物信息學(xué)分析［J］.生物技術(shù)通報,2010（4）：116-121.

［13］Kim I J,Ko K C,Kim C S,et al.Isolation and characterization of cDNAs encoding β-carotene hydroxylase in Citrus ［J］.Plant Science,2001,161(5):1005-1010.