張麗華

（山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

辣根過氧化物酶在酚類廢水中的應(yīng)用

張麗華

（山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

辣根過氧化物酶（HRP）是一種重要的含血紅素酶，具有結(jié)構(gòu)特殊、酶源豐富、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在眾行業(yè)中用途廣泛。本文綜述了辣根過氧化物酶的特性、作用機(jī)理及辣根過氧化物酶處理酚類廢水的應(yīng)用，并對現(xiàn)存問題和解決途徑進(jìn)行了探討。

辣根過氧化物酶；酚類廢水；廢水處理

環(huán)境水污染的監(jiān)控與治理是備受國內(nèi)外研究者關(guān)注的課題，含酚廢水又是當(dāng)今世界危害最大的工業(yè)廢水之一。酚類化合物種類繁多，有苯酚、甲酚、氨基酚、硝基酚、萘酚、氯酚等，這些都是有毒物質(zhì)，有些有致癌、致畸以及突變的潛在毒性，一方面嚴(yán)重威脅著人類的健康與環(huán)境，另外對動物和農(nóng)作物都有巨大的危害。含酚廢水主要來自焦化廠、樹脂廠、塑料廠、鋼鐵廠、合成纖維廠、紡織廠、煤氣廠、石油化工廠、絕緣材料廠、加工林木長等工業(yè)部門以及石油裂解制乙烯、合成苯酚、聚酰胺纖維、合成染料、有機(jī)農(nóng)藥和酚醛樹脂生產(chǎn)過程。由于含酚廢水的組成、酸堿性以及濃度的不同，處理方法也不同，目前，工業(yè)中處理酚類廢水的方法有物理法、化學(xué)法和生化法等三大類，其中包括焚燒法、活性炭吸附法、化學(xué)或酶氧化法、溶劑萃取法、微生物降解法等[1-2]。采用物理處理法對處理條件要求極高，而且設(shè)備昂貴；采用化學(xué)處理法容易導(dǎo)致二次污染；利用生物中的微生物降解酚類廢水，則需要大規(guī)模培養(yǎng)微生物且耗時長，空間大，同時含酚廢水對微生物存在毒害作用[3]。自1980年Klibanov等[4-5]首次將辣根過氧化物酶（HRP）用于處理酚類和苯胺類廢水以來，用生物酶處理酚類廢水的研究得到了廣泛應(yīng)用。很多工作者對此作出大量的研究，并證實用HRP處理工業(yè)廢水中的酚類污染物具有高效性、反應(yīng)條件溫和且容易控制、能量要求低、受環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有潛力的廢水處理方法，因此，這一新興的酶處理技術(shù)受到國內(nèi)外大量研究者的關(guān)注[6-7]。

1 辣根過氧化物酶的簡介

圖1 植物辣根的早期圖樣

辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP廣泛分布于植物界，辣根（圖1）中含量最高。它是一種卟啉鐵化合物，是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，中性糖和氨基糖約占18％，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由多個同工酶組成，其中以辣根過氧化物酶同工酶C（HRP C）的含量最為豐富，分子量約為44 000，等電點(diǎn)為pH 3～9，酶催化的最適pH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH=5左右。辣根過氧化物酶比活性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，分子量小，純酶也較容易制備，而且這種酶含有血紅素，能利用H2O2氧化許多有機(jī)及無機(jī)化合物，因此，辣根過氧化物酶具有廣泛的商業(yè)價值。在臨床診斷中可作為酶制劑和酶標(biāo)記，藉以檢驗體液和組織內(nèi)存在的多種疾??；還可用于電鏡技術(shù)，酶聯(lián)反應(yīng)和免疫印跡等生物學(xué)研究，同時在生物傳感器、木素降解、工業(yè)“三廢”處理等方面也有大量應(yīng)用。

2 辣根過氧化物酶的作用機(jī)理

辣根過氧化物酶屬于氧化還原酶類，它能夠以過氧化氫作為電子受體，專一地催化酚類和苯胺類物質(zhì)的過氧化反應(yīng)，這類反應(yīng)屬于雙底物酶促反應(yīng)，而且為乒乓雙雙反應(yīng)機(jī)制。過氧化物催化氧化酚類化合物的反應(yīng)機(jī)理如下[8]：

E+H2O→E1+H2O

E1+AH2→E2+·AH

E2+AH2→E+·AH+H2O

·AH+·AH→（AH）2

E代表酶，E1和E2是酶的中間體形式，分別稱為化合物I和化合物II，AH2是酚類化合物，其中AH2為電子供體，常為芳香胺或酚類化合物，·AH代表其自由基?？紤]到計量系數(shù)比的話，反應(yīng)方程式為：H2O2+2AH2→（AH）2+2H2O

根據(jù)光譜學(xué)、動力學(xué)和晶體衍射的研究，辣根過氧化物酶具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，這里我們以HRP C的結(jié)構(gòu)作介紹，如圖2[9]所示靜態(tài)的HRPC含有兩個不同的金屬中心：正鐵原卟啉環(huán)（FeIII）（常指血紅素）和2個鈣原子。這兩個金屬中心對于酶的結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性起到了必要的作用。從圖3[10]可以看出，第一個軸向結(jié)合點(diǎn)是由血紅素中鐵原子和肽鏈上組氨酸170位側(cè)鏈上的N原子結(jié)合的，而第二個軸向配體未被占用是為了酶在轉(zhuǎn)化過程中提供給過氧化氫的。HRPC催化氧化酚類衍生物的機(jī)理如圖4所示：催化循環(huán)開始于H2O2分子的異裂，第一步是由一分子HRP被H2O2氧化失去兩個電子，此過程需要來自血紅素的兩個電子的轉(zhuǎn)移，形成了一個水分子和化合物HRPI（氧化態(tài)為+V價）。HRP I此時以短暫的催化中間體形式存在，是血紅素過氧化物酶催化反應(yīng)典型的中間體，產(chǎn)生一個卟啉自由基陽離子[血紅素（Fe4+=O）]?；衔颕是不穩(wěn)定的，它是一種強(qiáng)的氧化劑。催化循環(huán)的第二步由一分子還原性酚類底物的加入，生成另一個含有含氧Fe（IV）中心的催化中間體HRPⅡ。由于HRPI和HRPⅡ都具有高氧化態(tài)，所以都是強(qiáng)氧化劑，氧化還原電勢約為+1 V。催化循環(huán)的第三步是再加入一分子還原性酚類底物，使HRPⅡ從第二個電子供體AH2上得到一個電子還原成靜態(tài)酶。在靜態(tài)酶中加入過量過氧化氫時，會使酶部分失活，這是由于生成了另外的一個催化中間體HRPIII，而中間體III又會引發(fā)另一系列的反應(yīng)。HRPIII被認(rèn)為是Fe（III）超氧化物與Fe（II）雙氧化物的雜合體[11]。

圖2 HRP C同工酶的三維結(jié)構(gòu)圖網(wǎng)狀為血紅素，球型為鈣原子，螺旋型為α螺旋，尖頭所指為β折疊

圖3 HRP C中血紅素連接區(qū)域的重要基酸殘基

圖4 HRP C催化酚類底物的機(jī)理

3 辣根過氧化物酶在酚類廢水中的應(yīng)用

Wagner等[12]人采用紫外分光光度計法，研究了辣根過氧化物酶催化氧化去除水溶液中酚類化合物的處理條件，還檢測了添加劑聚乙二醇（分子量35 000）、殼聚糖、過氧化氫以及反應(yīng)時間對HRP去除酚類化合物的影響；在同樣條件下，還測定了其他的酚類化合物的去除效果，包括苯酚、2-甲酚、2，4-二氯酚、2-氯酚和4-氯酚。結(jié)果表明，3 h是最佳降解效果，而且在過氧化氫存在的情況下，辣根過氧化物酶在3 h內(nèi)可除去約95％的酚類化合物。實驗過程中發(fā)現(xiàn)添加了過氧化氫以后降解過程明顯加速；同時也測得當(dāng)添加劑PEG存在時，3 h后酚類化合物的去除效果較殼聚糖更好；對于其他酚類化合物的檢測，發(fā)現(xiàn)21 h后酶反應(yīng)完全時，苯酚、2，4-二氯酚、2-氯酚和4-氯酚的降解效果明顯，但2-甲酚除外?？偨Y(jié)出酚類化合物的去除效果主要取決于HRP和過氧化氫的比例。

鄭琦等[13]人用辣根過氧化物酶催化處理鄰苯二酚廢水，結(jié)果表明，用辣根過氧化物酶可以有效地去除鄰苯二酚。其最佳處理條件為：pH值為4.4，過氧化氫與鄰苯二酚的摩爾比約2∶1，反應(yīng)時間為30 min。實驗測得適當(dāng)增加酶用量可以明顯縮短反應(yīng)時間。

張國平等[14]采用高效液相色譜法研究了用HRP對五氯酚的模擬廢水進(jìn)行催化聚合處理地過程，結(jié)果表明，HRP可以有效的去除五氯酚。反應(yīng)的最佳pH值為4～5，去除率可達(dá)95％以上。聚合處理過程中五氯酚與H2O2的反應(yīng)計量比為2∶1。反應(yīng)計量比及處理過程中氯的釋放實驗表明，五氯酚聚合作用的主要產(chǎn)物是二聚體。另外，反應(yīng)速度與酶和H2O2的用量有關(guān)，增加酶用量或適量增加H2O2的用量，可以明顯縮短反應(yīng)時間。

蔡奕璇等[15]利用酶在微水溶劑中的“構(gòu)象記憶”特性，以殼聚糖微球為載體，以辣根過氧化物酶為研究對象，將HRP于活性構(gòu)象下凍干“固定”后，V二氧六環(huán)∶V水=99∶1微水介質(zhì)中與載體進(jìn)行共價交聯(lián)，同時與傳統(tǒng)水介質(zhì)中共價交聯(lián)固定化的HRP進(jìn)行比較。結(jié)果表明，將1 g微水相固定的HRP和水相固定的HRP分別用于去除含量為2 mmol/L的苯酚，在相同條件下反應(yīng)5 min后，微水相固定化HRP對苯酚的去除率可達(dá)到63.86％，而水相固定的HRP對苯酚的去除效率僅為34.16％；反應(yīng)15 min以后，微水相固定化HRP對苯酚的去除效率已經(jīng)達(dá)到最高，為84.9％，而水相固定的HRP在反應(yīng)20 min后才達(dá)到最大值，去除率僅為72.51％。這表明了微水相共價固定化HRP在苯酚的去除中也更具優(yōu)勢。

Xu等[16]人利用電極酶催化氧化法，以磁性Fe3O4蠶絲蛋白納米球為載體，以HRP為研究對象，制備了固定化HRP。檢測了固定化HRP在一種無膜的電化學(xué)反應(yīng)器上催化雙酚A（2，2-雙對羥苯基丙烷）的研究，并測定了pH值、反應(yīng)溫度、最適電壓以及氧氣流入速度對雙酚A降解效果的影響和最適降解條件的選擇。結(jié)果表明：當(dāng)實際電壓為1.6 V，HRP固定量為0.5 U/mL，pH=5.0，溫度為25℃時，氧氣流入速度為26 mL/min時，雙酚A的去除率高達(dá)83％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他方法。

王杉霖[17]等人采用了Fe3O4吸附包埋固定辣根過氧化物酶，并運(yùn)用了明膠、開孔明膠、海藻酸鈉3種不同的固定化載體。結(jié)果表明：最佳給酶量與Fe3O4用量比約為95 U HRP/Fe3O4g，F(xiàn)e3O4用量與凝膠比例為1.0 g Fe3O4/10 mL 10％～20％，最適戊二醛濃度和交聯(lián)時間分別為0.5％和30min。在此條件下制備的辣根過氧化物酶活性約為1.1U/g，酶活固定率約為15％，也證明了該固定化酶可以重復(fù)應(yīng)用于五氯酚催化去除反應(yīng)中，且可獲得穩(wěn)定的五氯酚去除率。所以，使用固定化酶同溶解酶的反應(yīng)條件相似，但反應(yīng)活性有所提高，且酶可以重復(fù)利用，因此這是一種有希望降低成本的酶法處理工業(yè)廢水的新方法。

4 存在的問題及展望

隨著工業(yè)的飛速發(fā)展，含酚類廢水的排放也是日益嚴(yán)重，全球?qū)ζ潢P(guān)注程度也日益增強(qiáng)。美國環(huán)保局從7萬種有機(jī)物中篩選出65類129種優(yōu)先控制污染物名單；我國環(huán)境檢測總站也根據(jù)我國環(huán)境特征，提出了14類68種優(yōu)先控制污染物黑名單，因此迫切需要具有各種專門的廢水治理方法來降解其毒性。而利用生物酶的催化氧化作用來處理酚類、芳香胺類、染料類廢水的污染是一種綠色的合成方法，是近年來受到國內(nèi)外研究者重視的新方法，降解的結(jié)果有效地降低了有毒有機(jī)污染物的含量，同時也降低了毒性，是一種很有潛力的廢水處理方法。辣根過氧化物酶是一種應(yīng)用最為廣泛的酶，因為其易于提取，價格相對低廉，而且性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱及與有機(jī)溶劑作用后活性也損失很少。生物酶相較于化學(xué)法，條件溫和，專一性強(qiáng)，安全性高。但也有4點(diǎn)問題需要考慮：①很多酶法處理酚類廢水的工作機(jī)理和環(huán)境因素尚未完全明確，結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)的關(guān)系也未被深入地研究，在這方面還有許多問題亟待解決；②考慮到生產(chǎn)成本和經(jīng)濟(jì)效益，游離酶在高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等極端條件下易變性失活，嚴(yán)重限制了它的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，且酶是水溶性的，在酶促催化反應(yīng)后不使酶變性而回收酶相當(dāng)困難，所以使用固定化酶技術(shù)，必然會降低處理廢水的成本，提高酶的使用效果，也必然會受到越來越多人的關(guān)注，在工業(yè)生產(chǎn)的各個方面有推廣價值；③實際廢水是一個十分復(fù)雜的混合體系，用單一酶處理，一般很難達(dá)到要求，因此，對于復(fù)雜的廢水體系，是采用混合酶，還是單一酶分級處理，有待進(jìn)一步探索，所以，實驗室的研究與實際應(yīng)用還有一段很大的距離；④考慮到酶的來源，畢竟天然酶的來源是有限的，相對于含酚廢水的量而言，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，所以，我們應(yīng)該將天然酶發(fā)展到修飾酶、人工酶及超酶。

將非天然化合物的合成，作為酶工程今后發(fā)展的主要方向，使得酶具有更廣泛的應(yīng)用空間。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們將會在酶的應(yīng)用領(lǐng)域取得更加具有實際意義的研究進(jìn)展。

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Applications of H orseradish P eroxidase in the P henolic W astewater

ZHANG Li-hua
（School of Chemistry and Chemical Engineering，ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

Horseradish peroxidase（HRP）is an important heme-containing enzyme thathas been studied formore than a century.In recent years，HRP is recognized as themost versatile enzyme for applications of all kinds of fields due to its unique structure，its stability，plenty of source and low cost.The properties，mechanisms of catalysis and research progresses of Horseradish peroxidase in the treatment of phenols from wastewater were introduced significantly.The present problems and their solutions were discussed.So I think thatwe need to domore research in the field.

horseradish peroxidase；phenolic wastewater；wastewater treatment〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

1674-0874（2012）03-0035-05

Q554+.6，X703

A

2011-10-02

張麗華（1981-），女，山西大同人，碩士，助教，研究方向：生物無機(jī)酶。