李竹石，林 華，楊 健，楊會(huì)強(qiáng)，曾獻(xiàn)武，趙 宇，劉 俐，劉莉娜，康 莊，俞永新，李玉華*

(1.中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)公司成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都610023;2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050)

登革病毒(Dengue virus，DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬，分為1、2、3和4這4個(gè)不同的血清型，是一類(lèi)經(jīng)蚊媒傳播的單股正鏈RNA病毒。登革病毒可引起登革熱(Dengue fever，DF)及更嚴(yán)重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)與登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，目前尚無(wú)特異性藥物與疫苗問(wèn)世，因此已成為全球尤其是熱帶與亞熱帶地區(qū)人群健康的主要威脅之一。根據(jù)WHO發(fā)布的信息，全球每年約有1億登革熱患者，死亡達(dá)2.5萬(wàn)人。近年來(lái)，登革熱在我國(guó)的發(fā)病率亦呈顯著上升趨勢(shì)［1－3］。

登革病毒基因組編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中，結(jié)構(gòu)蛋白E包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域:I區(qū)、II區(qū)和III區(qū)，其中III區(qū)含有IgG免疫球蛋白樣折疊，并通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)，是登革病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的主要位點(diǎn)，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體和血凝抑制抗體的主要部位［4－9］。本研究分別將去除C端跨膜區(qū)的登革病毒4型E蛋白(DENV4E，402AA)以及 E 蛋白 III區(qū)(DENV4EIII，126AA)克隆到pET-32a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建兩種蛋白的表達(dá)載體，并利用 IPTG分別誘導(dǎo) DENV4E與DENV4EIII蛋白在原核細(xì)胞中大量表達(dá)，以表達(dá)的蛋白免疫家兔并采集血清，分別制備出針對(duì)DENV4E與DENV4EIII蛋白的多克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，從而為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Rosetta感受態(tài)細(xì)胞和pET-32a(+)質(zhì)粒(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒疫苗研究室保存);TOP10感受態(tài)細(xì)胞(北京天根公司);含有登革病毒4型(814669株)E蛋白編碼序列的TOPOD4prM/E質(zhì)粒(上海英駿生物技術(shù)有限公司構(gòu)建);登革病毒4型(H241株)(美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心提供);PrimeSTAR DNA聚合酶與異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Takara公司);凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司);BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶(NEB公司);脫脂奶粉(BD公司)、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma-Aldrich公司);核苷酸序列測(cè)定(上海英駿生物技術(shù)有限公司);免疫用雌性家兔(普通級(jí)，體質(zhì)量2.5～3.5 kg)［成都生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物室，許可證號(hào)SCXK(川)2011-08］。

1.2 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)登革病毒4型(814669株)序列(GenBank登錄號(hào)AF326573.1)設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增DENV4E與DENV4EIII片段(去除C端跨膜區(qū))，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列如下:DENV4E:5'-CGCGGATCCATGCGATGCGTAGGAGTAGGAAAC-3'(正向，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn));5'-C CGCTCGAGTTAAAACATCTTGCCAATGGAACTCC-3'(反向，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn));DENV4EIII:5'-CGCGGATCCTGCAAAGTCCGTATGGAGAAA-3'(正向，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn));5'-CCGCTC GAGTTATTTTGCACCTCTGTATGTGGACT-3'(反向，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

以 TOPO-D4prM/E質(zhì)粒為模板，采用 Prime-STAR DNA聚合酶擴(kuò)增DENV4E與DENV4EIII片段，切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pET-32a(+)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞后挑取克隆，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定以及測(cè)序分析，將插入序列正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET32-DENV4E和pET32-DENV4EIII。

1.3 DENV4E與DENV4EIII蛋白的表達(dá)

分別用 pET-32a(+)質(zhì)粒、pET32-DENV4E以及pET32-DENV4EIII表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，在37℃以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)DENV4E和DENV4EIII蛋白表達(dá)，并以裂解緩沖液重懸菌體，冰浴中超聲裂解，離心收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)DENV4E和DENV4EIII蛋白為可溶性表達(dá)或是以包涵體形式表達(dá)。

先后以2 mol/L尿素洗滌和8 mol/L尿素溶解DENV4E與DENV4EIII包涵體，通過(guò) SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，并采用Lowry法測(cè)定蛋白濃度。

1.4 DENV4E與DENV4EIII多克隆抗體的制備

分別用表達(dá)的DENV4E與DENV4EIII蛋白免疫家兔，首次免疫后14及21 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫以弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫的蛋白量約為1 mg。另以8 mol/L尿素免疫家兔作為對(duì)照。末次免疫后7 d采集血清。

1.5 多克隆抗體的Western blot鑒定

取適量登革病毒4型(H241株)全病毒裂解物進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以溶解于PBS的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用上述制備的多克隆抗體以及陰性對(duì)照血清(牛奶稀釋?zhuān)♂尪染鶠?∶40)4℃孵育過(guò)夜。PBS洗膜，以堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育1.5 h，PBS洗膜后以BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 pET32-DENV4E與 pET32-DENV4EIII表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增得到的 DENV4E(1206 bp)與DENV4EIII(378 bp)片段分別插入pET-32a(+)質(zhì)粒后，取大小正確的重組質(zhì)粒(圖1)進(jìn)行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致(圖2)。核苷酸序列測(cè)定顯示插入片段與目的片段序列完全一致且讀碼框正確。

圖1 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達(dá)載體Fig 1 pET32-DENV4E and pET32-DENV4EIII expression vectors

2.2 DENV4E與DENV4EIII蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達(dá)載體的酶切鑒定Fig 2 Restriction enzyme digestion of pET32-DENV4E and pET32-DENV4EIII

含有 pET32-DENV4E與 pET32-DENV4EIII表達(dá)載體的Rosetta感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，可見(jiàn)明顯蛋白條帶，分別與DENV4E和DENV4EIII蛋白的預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量相符(DENV4E:64 ku;DENV4EIII:33 ku)(圖3)。菌體經(jīng)超聲裂解后，結(jié)果顯示兩種蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖4)。以尿素洗滌和溶解包涵體，能夠得到純度較高的DENV4E和DENV4EIII蛋白(圖5)。蛋白濃度可達(dá)1.0 g/L左右。

圖3 Rosetta菌體裂解物的SDS-PAGE檢測(cè)Fig 3 SDS-PAGE of Rosetta cell lysates

圖4 Rosetta菌體超聲裂解后上清液與沉淀的SDS-PAGE檢測(cè)Fig 4 SDS-PAGE of the supernatant and pellet of Rosetta cells after sonication

圖5 DENV4E與DENV4EIII蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE檢測(cè)Fig 5 SDS-PAGE of purified DENV4E and DENV4EIII proteins

2.3 多克隆抗體的Western blot鑒定

DENV4E、DENV4EIII多克隆抗體與登革病毒4型(H241株)全病毒裂解物雜交后，均在病毒E蛋白相應(yīng)位置(55 ku)出現(xiàn)明顯條帶，而陰性對(duì)照血清與全病毒裂解物雜交后未出現(xiàn)條帶(圖6)。

圖6 多克隆抗體對(duì)登革病毒4型的Western blot檢測(cè)Fig 6 Western blot of dengue virus type 4 using the prepared polyclonal antibody

3 討論

位于登革病毒表面的E蛋白是其最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，介導(dǎo)諸多功能。E蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)等3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中III區(qū)為IgG免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，含有型和亞型特異性抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［4－9］。由于目前尚無(wú)市售的針對(duì)登革病毒4型E蛋白的特異性抗體，因此對(duì)該型病毒的研究造成了一定困難。為解決這一問(wèn)題，本研究在原核細(xì)胞中表達(dá)登革病毒4型E蛋白與E蛋白III區(qū)，并通過(guò)免疫家兔制備多克隆抗體。為提高目的蛋白的表達(dá)效率，本研究去除了 E蛋白編碼序列 C端約300 bp的跨膜區(qū)，獲得了表達(dá)量較好的蛋白，其結(jié)果與文獻(xiàn)［10］的研究結(jié)果一致。此外，本研究以pET-32a(+)質(zhì)粒作為載體，表達(dá)出硫氧還蛋白與目的蛋白的融合蛋白，以促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)。但在對(duì)表達(dá)溫度、時(shí)間及IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化后，并不能顯著增大蛋白的可溶性，DENV4E與DENV4EIII蛋白仍然主要以包涵體的形式表達(dá)。經(jīng)尿素洗滌、溶解后，蛋白濃度可達(dá)1.0 g/L左右，可達(dá)到本研究的需求。推測(cè)兩種蛋白以包涵體的形式表達(dá)可能是由其序列本身所決定的。

登革病毒4型完整E蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為55 ku，去除C端跨膜區(qū)的E蛋白及其III區(qū)分別為45與14 ku，由于N端融合了硫氧還蛋白，因此最終表達(dá)的DENV4E與DENV4EIII分別為64與33 ku。盡管并非完整的E蛋白，但由于兩者均含有E蛋白的主要抗原表位，因此兩者足以誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生高水平的免疫反應(yīng)，所制備的多克隆抗體能夠從登革病毒4型全病毒裂解物中成功檢測(cè)到完整的病毒E蛋白(55 ku)。需要指出的是，所制備的抗體在對(duì)病毒裂解物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)了非特異性條帶，其原因可能是因?yàn)槎嗫沟奶禺愋詿o(wú)法與單抗相比，以及病毒表面的E蛋白同源二聚體可能與多抗發(fā)生反應(yīng)。但總體而言，考慮到目標(biāo)條帶清晰，且非特異性條帶未對(duì)結(jié)果造成干擾，因此本研究制備的多克隆抗體的檢測(cè)效果是可接受的。該研究結(jié)果為登革病毒E蛋白抗原表位肽及登革亞單位疫苗的研究提供了依據(jù)，也解決了登革疫苗開(kāi)發(fā)中所面臨的抗登革病毒抗體缺乏的瓶頸問(wèn)題。

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