薄冰常蕓

1 上海體育學院（上海 200438）

2 國家體育總局體育科學研究所

·基礎研究·

力竭運動對大鼠竇房結(jié)超級化激活環(huán)核苷酸門控通道的影響

薄冰1，2常蕓2

1 上海體育學院（上海 200438）

2 國家體育總局體育科學研究所

目的：探討2周力竭運動對大鼠竇房結(jié)超級化激活環(huán)核苷酸門控通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達及通道電流密度的影響。方法：健康雄性SD大鼠180只，8周齡，體重（220±8）g，共分9組，每組20只，包括安靜對照組（C組）1組、一次力竭組（O組）4組和反復力竭組（R組）4組。安靜對照組不施加任何運動影響，反復力竭各組大鼠尾部負重為體重的3%，每天1次力竭游泳，每次運動時間控制在2小時左右，每周運動6天，共2周，一次力竭組大鼠在正常喂養(yǎng)2周后進行一次力竭游泳運動，運動方案同反復力竭組。運動組大鼠分別于運動后即刻、4小時、12小時、24小時不同時相取材，一次力竭運動各組分別命名O-0h、O-4h、O-12h、O-24h，反復力竭運動各組分別命名R-0h、R-4h、R-12h、R-24h。應用實時熒光定量PCR技術測定HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達變化，細胞急性分離及全細胞膜片鉗技術測定通道電流密度變化，觀察力竭游泳運動對大鼠竇房結(jié)細胞膜上HCN通道的影響。結(jié)果：（1）與對照組相比，一次力竭組O-0h組HCN1、HCN4mRNA相對表達量顯著升高（P<0.05，P<0.01），O-4h組HCN1、HCN4顯著升高（P<0.01，P<0.05）；反復力竭組R-0h與R-4h組HCN1顯著下降（P<0.01，P<0.01）；反復力竭各組HCN2、HCN4 mRNA表達顯著下降（P< 0.01）。（2）反復力竭各時相組HCN通道電流密度顯著低于對照組及一次力竭組。結(jié)論：兩周力竭運動可引起竇房結(jié)HCN通道亞基HCN2及HCN4 mRNA表達下降，通道If電流密度減少，這可能成為運動引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的離子通道機制之一。

力竭運動；竇房結(jié)；超級化激活環(huán)核苷酸門控通道

竇房結(jié)（SAN）細胞以舒張期緩慢自動除極為特征，即在動作電位末期自發(fā)除極至下一動作電位的閾電位，這也是竇房結(jié)細胞生成自發(fā)起搏活動的電學基礎［1］，同時也是建立在起搏細胞膜上多種離子通道共同活動的基礎之上。在參與起搏活動產(chǎn)生及調(diào)節(jié)的多種機制中，HCN通道攜帶的“funny電流”作為起搏電流，發(fā)揮著極其重要的作用［2，3］。

1977 年，Normo等［4］在對兔竇房結(jié)進行研究時發(fā)現(xiàn)一種特性與眾不同的電流，將其命名為“funny電流 （funny current，If）”。 隨著研究的不斷深入，DiFrancesco等［5］發(fā)現(xiàn)該電流在竇房結(jié)細胞超級化時被激活，因而該電流也稱為超級化激活電流，攜帶這一電流的通道被稱為超級化激活環(huán)核苷酸門控通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels，HCN channel）。If是由Na+和K+組成的混合型陽離子電流，稱之為“funny電流”，是因為在生理條件下，If的激活是通過超級化電壓階躍至接近細胞靜息電位的內(nèi)向電流，約為-40 mV，這表現(xiàn)出If的開放與靜息期膜電位的關系?；谶@一特性，Brown等［6］認為If參與靜息電位并引起細胞膜動作電位除極；If的最大激活電位在-100mV，完全活化電流―電壓關系曲線顯示反轉(zhuǎn)電位接近-10 mV，表明If在細胞舒張期去極化生成中的重要作用。因為內(nèi)向電流的激活可引起去極化，If的激活電壓與竇房結(jié)細胞舒張期去極化電壓（接近-40 mV到-65 mV）重疊，因此，If適宜成為舒張期去極化的“起搏”電流。

從小鼠［7］、兔［8］和人［9］中克隆出4種編碼生成If電流的HCN通道基因亞型，命名為HCN1-4。每種亞型都含有6個跨膜區(qū)域和1個環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域（cyclic nucleotide-binding domain，CNBD）。HCN通道的4種基因亞型在哺乳動物心臟組織中均被發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)組織的主要亞型是HCN1、HCN2和HCN4，負責形成攜帶If電流的通道，其中，最主要的HCN轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是HCN4。

相關研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道改變可導致竇房結(jié)產(chǎn)生自發(fā)起搏活動及其頻率異常［2，3］，但運動醫(yī)學領域關于運動對于竇房結(jié)細胞HCN通道的影響卻未見報道，因此，本文即以HCN通道亞基mRNA表達及通道電流密度為切入點，應用實時熒光定量PCR、細胞急性分離及全細胞膜片鉗技術，觀察力竭游泳運動對大鼠竇房結(jié)細胞膜上HCN通道的影響，為進一步探討運動性竇房結(jié)功能障礙及運動性心律失常提供實驗論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性SD大鼠180只，8周齡，體重（220±8）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號2011-0001。動物提取后，隨機分為9組，每組20只，包括安靜對照組1組、一次力竭組4組和反復力竭組4組。運動組大鼠分別于運動后即刻、4小時、12小時、24小時不同時相取材，一次力竭運動各組大鼠分別以O-0h、O-4h、O-12h、O-24h命名，反復力竭運動各組大鼠分別以R-0h、R-4h、R-12h、R-24h命名，以觀察運動結(jié)束后竇房結(jié)HCN通道亞基mRNA表達及電流密度變化與時間的關系。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（18±2）℃，光照時間12小時，相對濕度為40%～50%。本實驗在國家體育總局體育科學研究所分子生物學實驗室及病理學實驗室完成。

1.2 運動方案

安靜對照組不施加任何運動。運動組大鼠進入動物房后先適應3天，然后進行2天適應性游泳運動（20分鐘/次）。反復力竭各組大鼠尾部負重約為體重的3%，進行2周力竭游泳，每周運動6天，每天1次，每次運動2個小時左右。每次運動結(jié)束后，用干毛巾迅速擦干大鼠身上水分，電吹風把毛吹干后，放回籠中休息。并在最后一次力竭游泳后即刻、4小時、12小時、24小時不同時相取材。一次力竭運動各組大鼠正常喂養(yǎng)2周后，進行一次性力竭游泳運動，尾部負重約為體重的3%，并在力竭運動后即刻、4小時、12小時、24小時不同時相取材。力竭標準參照Thomas［10］的報道，即經(jīng)過10s后動物仍不能返回水面，并且撈出后置于平面不能完成翻正反射。

1.3 測試方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測

1.3.1.1 大鼠心臟竇房結(jié)組織取材

使用10%水合氯醛（1ml/100g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠結(jié)膜反射、翻正反射消失后，仰臥固定，75%酒精消毒胸腹部皮膚。打開胸腔后游離出上腔靜脈，沿離心方向約0.5 cm處剪斷；沿著界溝行切口打開右心房進入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細胞。

1.3.1.2 大鼠心臟竇房結(jié)總RNA提取

采用TRIzol法提取心臟竇房結(jié)總RNA。將收集管中的細胞或細胞團轉(zhuǎn)移到含有1ml TRIzolReagent的EP管中，顛倒混勻，室溫靜置5～10 min，加入200 μl氯仿，手動劇烈震蕩混勻15 s，室溫靜置2～3 min，4℃、12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，轉(zhuǎn)上層水相（500～600 μl）于另一新1.5m l EP管中，加等體積異丙醇（500～ 600μl），混勻，室溫放置30min。棄上清，加DEPC水溶液溶解，-80℃保存。

1.3.1.3 逆轉(zhuǎn)錄RNA合成為cDNA

根據(jù)樣品數(shù)量按下列反應體系配制反應混合液，引物Oligo（dT），10 pmol/μl（2μl）、10 mM dNTP mix（4μl）、H2O（24μl）共30μl。將混合液分裝到0.2 ml PCR管中，分別加入2μl RNA（約2μg左右），70℃變性5min，冰上速冷2min，離心將溶液收集至管底。按順序根據(jù)下列反應體系配置混合反應液：5×PCR buffer（10μl）、DTT（6μl）、M-MLV RT（酶）（MMLV-Promega）（2μl），共18μl。將上述混合物分裝到上述0.2 ml PCR管中，共計50μl體系。42℃延伸50min，95℃保溫5min終止反應。cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 引物設計及合成

通過互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找基因序列，應用Primer5軟件進行引物設計，將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性，所有引物擴增目的基因片斷長度均小于150 bp。設計的引物由Invitrigin公司合成。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.3.1.5 SYBR GREEN熒光定量PCR

將cDNA和引物解凍，取定量PCR用的96孔板，按如下成分加入：RealqPCR Master Mix（12μl）、引物F/R （上下游引物終濃度均為10 pmol/μl）（0.5/ 0.5μl）、H2O （11μl）。最后加入相對應的cDNA（1 μl），共25μl，封膜。打開ABI7900HT定量PCR儀，進行實時定量PCR實驗，反應條件如下：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，（生成擴增曲線）；95℃ 15 s，60℃60 s，95℃15 s（生成溶解曲線），上述反應共40個循環(huán)。

1.3.1.6 mRNA結(jié)果分析

觀察溶解曲線，判斷PCR特異性；以2-△△Ct作為計算公式，分析各組mRNA表達差異，每個反應重復3次，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實驗組與對照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

1.3.2 大鼠竇房結(jié)細胞膜HCN通道電流密度測定

1.3.2.1 大鼠竇房結(jié)細胞急性分離

［11，12］，將分離后的心臟行主動脈逆行插管，固定后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以普通Tyrode液灌流3～5 min，灌流速度7 ml/min，靜水壓70 cmH2O，溫度37℃。待心腔內(nèi)殘血全部流出后，將普通Tyrode液換成無Ca2+-Tyrode液以消除自發(fā)節(jié)律。從灌流裝置上取下心臟，在無Ca2+-Tyrode液中沿著界溝行切口打開右心房進入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細胞。分離的竇房結(jié)組織置于2ml離心管中，管中充滿2ml含有0.85mg/ml Collagenase II、0.4 mg/ ml Elastase type II-A和13.5μl/ml Protease（1 mg/ 100μl）的無Ca2+-Tyrode液，并置于37℃水浴20～23 min。最后，將條形組織轉(zhuǎn)移至含有KB液的培養(yǎng)皿中，更新3次KB液以去除酶液。用尖端直徑2mm的玻璃吸管輕柔吹打KB液7～9min，使用200目微孔不銹鋼濾網(wǎng)過濾去除結(jié)締組織和未消化細胞，濾液于室溫下靜置30min以備用。實驗環(huán)境溫度在18～28℃之間，實驗中所有灌流液均用醫(yī)用純氧飽和并在灌流過程中持續(xù)通氧。

1.3.2.2 全細胞膜片鉗記錄大鼠竇房結(jié)HCN通道電流密度

取出完成貼壁的竇房結(jié)細胞培養(yǎng)皿，置于倒置顯微鏡下，用氧飽和的電極外液灌流，灌流速度約1 ml/min，沖去死亡細胞碎片。選取處于靜息狀態(tài)下的表面光滑、橫紋清晰、折光好、立體感強的單個SAN細胞為研究對象。本研究采用硅酸鹽硬質(zhì)玻璃制作記錄電極 （武漢華中科大儀博生命科學儀器有限公司），經(jīng)P-97（Sutter美國）水平拉制儀兩步拉制而成。電極充灌電極液后電阻為2.5～3.5MΩ。將玻璃微電極安置于膜片鉗放大器（HEKA EPC10德國）前端探頭夾持器上，然后緩慢調(diào)節(jié)微操儀推動電極尖端接觸到細胞膜，當電阻值達到1～2GΩ時即形成高阻封接，此時補償快電容，然后采用脈沖式負壓吸引，將封接吸入電極尖端內(nèi)的細胞膜片吸破，即“破膜”，使電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相溝通，形成全細胞記錄狀態(tài)，示波器上顯示跨細胞膜電容電流，隨后進行慢電容補償（C-Slow Capacitance compensation），并記錄細胞膜電容值。實驗刺激信號由pulse+pulsefit8.6軟件控制，通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導入細胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC10放大、濾波，將記錄的原始數(shù)據(jù)圖像存入計算機硬盤。在pulse8.6應用程序中打開原始數(shù)據(jù)文件，找出各道指令電壓下的電流圖，測定其電流值。實驗溫度為18～28℃。

1.3.2.3 溶液配制

正常臺氏液（mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，CaCl22，Glucose 10， （pH 7.4 NaOH）；無鈣臺氏液 （mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH 7.4 NaOH）；KB液 （mmol/L）：L-谷氨酸120，KOH 80，EGTA 0.3，KCl 20，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH 7.4 KOH）。消化酶液（mmol/L）：5m l無鈣臺氏液中加入0.85mg/ ml CollagenaseⅡ、0.4mg/ml Elastase type II-A和13.5 μl/m l Protease（1mg/100μl）；HCN通道電極內(nèi)液（mmol/ L）：K-aspartate 110，KCl 20，MgCl21，Na2ATP 5，Na-GTP 0.1，HEPES 10，Na-phosphocreatine 5，EGTA 5，（pH 7.3 KOH），0.22μm微孔濾膜過濾后分裝于1 mlEP管，-20℃冰箱儲存；HCN通道電極外液（mmol/ L）：NaCl 140；KCl 5.4；HEPES 10，MgCl21，CaCl21，Glucose 10，BaCl21（阻斷內(nèi)向整流K+通道），（pH 7.4 NaOH）。CollagenaseⅡ購于Worshington Biochemical公司，EGTA、HEPES、L-谷氨酸、Na2ATP、Na-GTP、Elastase type II-A及Protease均購于Sigma公司，其它試劑為化學分析純。

1.4 統(tǒng)計學分析

全細胞膜片鉗實驗結(jié)果以通道電流密度數(shù)值表示，電流密度為電流強度與膜電容的比值（pA/pF），其中電流強度為實驗所測量電流峰值，膜電容為實驗中記錄到的單個細胞電容值。實驗結(jié)果中各通道電流密度以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實驗組與對照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠竇房結(jié)HCN通道亞基mRNA表達

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

如表2所示，與對照組相比，一次力竭組，O-0h組HCN1、HCN4顯著升高（P<0.05，P<0.01），O-4h組HCN1、HCN4也出現(xiàn)顯著升高 （P<0.01，P< 0.05），O-12h組和O-24h組無顯著變化；反復力竭組R-0h與R-4h組HCN1 mRNA表達顯著下降 （P< 0.01，P<0.01），隨著取材時間的延長，HCN1呈上長升趨勢，R-12h、R-24h組與對照組相比無顯著差異；反復力竭各組HCN2、HCN4 mRNA表達顯著下降，顯著低于對照組及一次力竭組（P<0.01），分析數(shù)據(jù)趨勢可見，隨著運動結(jié)束后休息及取材時間的延長，HCN2與HCN4相對表達量逐漸增加，但仍未恢復至對照組水平。

表2 各組大鼠竇房結(jié)HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4m RNA相對表達量（2-△△Ct）

2.2 各組大鼠竇房結(jié)HCN通道電流密度

在電極外液中加入1 mmol/L BaCl2以阻斷內(nèi)向整流K+通道，當形成全細胞封接后，給予細胞保持電位-40 mV，以10 mV步階，-50 mV～-110 mV、3000 ms的階梯刺激方波，然后復極至-40mV，記錄到If電流（如圖2）。當SAN細胞經(jīng)由含2mmol/LCsCl的正常臺式液灌流5 min后，按照同一鉗制方案無法記錄到內(nèi)向電流，表明這一超級化激活內(nèi)向電流為If電流。如表3所示，與對照組相比，一次力竭運動對于大鼠竇房結(jié)HCN通道If電流密度無明顯影響，反復力竭各時相組If電流密度顯著下降（P<0.01）。

表3 各時相組大鼠竇房結(jié)細胞HCN通道電流密度（pA/pF）

圖2 對照組（A）和反復力竭即刻組（B）大鼠竇房結(jié)If電流原始圖

圖3 對照組、一次力竭組即刻組和反復力竭即刻組I-V曲線

3 討論

竇房結(jié)起搏細胞中，HCN通道是唯一在膜超級化電位被激活的電壓依賴性通道，該通道可在復極化后期接近最大舒張電位時開放。根據(jù)電流學觀點，HCN通道攜帶的起搏電流If可以啟動舒張期去極化的第一部分直至達到T型和L型Ca2+通道的激活閾電位［13，14］。 Ludwig等［15］在人類心臟中發(fā)現(xiàn)兩種起搏通道，If的快成分和慢成分分別是HCN2和HCN4。Stieber等［16］指出，HCN2能夠阻止舒張期膜電位向更負的方向變化，而HCN4主要維持起搏頻率的穩(wěn)定，并隨著機體不同的生理狀態(tài)而調(diào)節(jié)頻率。

Ludwig等［17］發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟HCN2通道失活可導致竇房結(jié)節(jié)律障礙以及離體竇房結(jié)細胞中If減小，這提示HCN2基因失活可減慢HCN通道活化速率。然而，HCN2基因敲除小鼠心率并未下降，而表現(xiàn)出間隔很短的竇性心律失常，實驗小鼠其它心臟節(jié)律參數(shù)均正常。該研究小組還觀察到竇房結(jié)細胞中，由cAMP刺激的最大If電流也未發(fā)生變化。由此可見，HCN2基因敲除小鼠的竇房結(jié)節(jié)律障礙提示，該通道可能在穩(wěn)定心率方面發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)［18］，HCN2離子孔道改變不僅抑制HCN2通道電流，而且減少HCN4通道電流，而HCN2變異孔道的過度表達會引起負性抑制或If“敲除”效應，導致初生大鼠心肌細胞自發(fā)節(jié)律活動消失。這進一步說明HCN通道是重組的，某一通道亞基基因表達變化會影響到其它亞基在通道組成中所占的合適比例，進而影響亞基所發(fā)揮的功能。本實驗發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動未引起HCN2mRNA表達變化，而反復力竭運動則導致大鼠竇房結(jié)HCN2基因表達下降，長時間大強度運動引起的HCN2基因下調(diào)并與其它亞基HCN1和HCN4基因表達下降協(xié)同作用，引起竇房結(jié)起搏細胞HCN通道的If電流變化，可能誘發(fā)與HCN2基因敲除小鼠類似的竇性心律失常發(fā)生。

HCN4作為HCN通道的主要亞基，其編碼的通道參與形成了80%竇房結(jié)細胞If，這一超級化激活的電流參與竇房結(jié)細胞膜舒張期膜電位的自動除極。Chandler等［19］應用聚合酶鏈反應結(jié)合原位雜交和免疫熒光染色法對人竇房結(jié)、右心房組織相關離子通道m(xù)RNA表達進行分析，結(jié)果表明，與右心房相比，竇房結(jié)HCN4 mRNA表達更高。Xiao等［20］采用Realtime PCR技術檢測竇房結(jié)和心房組織HCN通道基因表達，發(fā)現(xiàn)人竇房結(jié)組織HCN4表達水平高達75%，可見，HCN4通道在心臟搏動的形成中發(fā)揮至關重要的作用。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，HCN4基因改變與遺傳性竇性心動過緩相關［21，22］，心臟全部或局部HCN4通道失活可引起小鼠胚胎致命性損害，小鼠胚胎缺失HCN4可導致發(fā)育停止［23，24］，胚胎期HCN4基因缺陷小鼠在胚胎期第10天出現(xiàn)心率緩慢，心臟搏動頻率減少了40%；HCN4基因敲除小鼠胚胎在受精后9～12天死亡［25］。此外，HCN4基因缺陷小鼠心臟不能被腎上腺素所激動，導致cAMP失去對心率的調(diào)節(jié)作用。這提示至少在胚胎時期前11.5天內(nèi)的胚胎心臟中，HCN4通道基因并非形成心臟搏動的首要因素，而該通道也是心率自主調(diào)節(jié)所必須的重要因素。HCN4通道亞基在成年期小鼠中的作用與胚胎期不同。如，并未在缺少HCN4的成年小鼠身上觀察到發(fā)育停止或死亡。Herrmann等［25］建立的HCN4基因敲除小鼠（H cn4Cmouse）模型表明，H cn4C成年小鼠發(fā)育正常，但竇房結(jié)細胞If電流減少80%，并表現(xiàn)出以反復竇性停搏為特征的心律失常，活動時這一癥狀減少，恢復基礎心率后，竇性停搏再次出現(xiàn)?？梢姡赡闔 cn4C小鼠以反復發(fā)生竇性停搏為特征，Hermann等［25］等發(fā)現(xiàn)，H cn4C小鼠竇房結(jié)起搏細胞超級化電壓約增加8 mV，且在基礎狀態(tài)下不會自發(fā)性除極，但這種功能損害可以通過應用腎上腺素刺激彌補。上述研究結(jié)果提示，在成熟的竇房結(jié)細胞中，HCN4通道可以提供一個穩(wěn)定的起搏電位，但多數(shù)條件下，尤其是交感神經(jīng)刺激下，HCN4似乎并不能提升起搏活動的穩(wěn)定性。然而，隨著復極電流的增加，例如迷走神經(jīng)興奮或心臟由興奮期過渡到恢復期，HCN4通道激活并提供除極電流，從而保持系統(tǒng)的良好平衡。這種“除極儲備”的缺失可以解釋HCN4基因敲除小鼠發(fā)生竇性停搏的機制。這表明，HCN4是腎上腺素調(diào)節(jié)竇房結(jié)活動的重要機制之一。綜合既往研究可見，HCN4基因表達變化與竇房結(jié)細胞HCN通道介導的If電流變化及神經(jīng)系統(tǒng)對心率的調(diào)節(jié)密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，兩周力竭游泳運動導致大鼠竇房結(jié)細胞HCN4 mRNA表達明顯下降，提示反復大強度運動可導致HCN4基因表達下調(diào)，可能引起HCN4通道介導的If電流的改變，同時，離體竇房結(jié)細胞If電流密度減小，這與既往研究［25］一致。此外，HCN4結(jié)構(gòu)中所包含的cAMP結(jié)合區(qū)域CNBD的缺失和突變與心率的穩(wěn)定及神經(jīng)系統(tǒng)對心率的調(diào)節(jié)密切相關，反復大強度運動引起的HCN4基因表達下調(diào)可能削弱訓練比賽中交感神經(jīng)張力增高所誘導的心率增加，而這種竇房結(jié)活動的減弱及交感神經(jīng)反應性下降可能導致竇性停搏、異位起搏點等惡性心律失常出現(xiàn)，以及心輸出量減少所導致的心、腦、腎等器官無法滿足機體運動需求等猝死危險因素的增加。

結(jié)合力竭游泳運動對HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達影響的研究結(jié)果，本實驗進一步對HCN通道攜帶的If電流變化進行了測量。結(jié)果表明，兩周反復力竭運動明顯降低If電流密度，下降幅度達37%，隨著時間延長，電流密度變化呈上升趨勢，但在24 h內(nèi)仍明顯低于對照組?？梢姡邚姸?、長時間的運動訓練可能導致If電流密度下降，而該通道電流減少可導致竇房結(jié)功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，離體竇房結(jié)組織和起搏細胞中阻斷HCN通道If可減慢起搏活動，在體實驗也發(fā)現(xiàn)類似效應。If電流對Cs+的敏感性被用來推斷If在竇房結(jié)起搏活動中的作用，2～5mmol Cs+可顯著減慢起搏速率。Gao等［26］在2009年的研究進一步證實If在竇房結(jié)細胞起搏活動形成及調(diào)節(jié)中的作用。該研究小組對急性分離的狗竇房結(jié)細胞使用If阻斷劑ZD7288 3μM后發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)細胞的自發(fā)活動速率下降幅度達27%并出現(xiàn)不規(guī)律，4期自動除極也受到影響。ZD7288還導致最大舒張電位負向增加3 mV，這一現(xiàn)象說明If在穩(wěn)定膜舒張期電位中具有重要作用。舒張期去極化包含兩個部分，早期的線性部分和后期的非線性部分，綜合既往研究［27，28］發(fā)現(xiàn)，If可能與早期的線性部分有關。 阻斷If后還可影響β-腎上腺素受體對竇房結(jié)細胞動作電位速率的增加效應。Gao等［26］使用異丙腎上腺素灌流竇房結(jié)細胞，發(fā)現(xiàn)與未使用阻斷劑組相比，預先使用ZD7288的細胞自發(fā)活動明顯下降，其它兩種If阻斷劑ivabradine和Cs+也可引起類似效應?？梢?，If在β-腎上腺素加速竇房結(jié)自發(fā)活動中具有重要的作用。

力竭運動對大鼠竇房結(jié)細胞HCN通道影響的原因可能與運動心臟在神經(jīng)體液因素調(diào)節(jié)下，結(jié)構(gòu)、功能及代謝諸方面的心臟重塑有關。竇房結(jié)內(nèi)細胞具有能量代謝低的特點，這是竇房結(jié)在缺血缺氧、代謝抑制等非生理條件下維持心臟正常節(jié)律的重要結(jié)構(gòu)基礎。然而，長時間、高強度的反復訓練仍會造成竇房結(jié)細胞和組織的損傷性改變。朱永澤等［29］通過組織學研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動即可造成竇房結(jié)內(nèi)的P細胞和T細胞發(fā)生損傷性改變，1周反復力竭運動則引起竇房結(jié)細胞內(nèi)線粒體彌漫性增生、大量凋亡細胞散在分布、起搏細胞間連接混亂等超微結(jié)構(gòu)改變。Moffat等［30］研究Langendorff灌流心臟發(fā)現(xiàn)，缺血可引起心率減慢。Gryshenko等［31］應用低pH（6.6）“缺血”Tyrode’s模擬缺血條件下的細胞外酸性環(huán)境，發(fā)現(xiàn)兔竇房結(jié)細胞的起搏活動周期也相應改變，如舒張期去極化減慢、動作電位幅度減少等，在代謝抑制兔竇房結(jié)細胞中觀察到If減弱，結(jié)合運動訓練后的竇房結(jié)組織學改變可以發(fā)現(xiàn)，反復大強度運動訓練導致的竇房結(jié)缺血缺氧改變可能是竇房結(jié)細胞膜上HCN通道亞基及電流發(fā)生改變的原因之一。然而，與之前研究中模型的不同之處在于，兩周力竭游泳運動對大鼠竇房結(jié)缺血缺氧的影響程度與直接進行“缺血”Tyrode’s液灌流有明顯差異，對于竇房結(jié)細胞HCN通道電流的改變也不盡相同，因此，評估運動訓練中不同強度、類型、持續(xù)時間造成竇房結(jié)組織缺血缺氧的程度及對HCN通道的影響還需深入探討。此外，多種病理狀態(tài)，如心房纖顫［32，33］、心肌肥厚、心肌梗死或心力衰竭等，均存在竇房結(jié)、心房和心室HCN2、HCN4通道基因的表達異常，導致心臟不同部位心肌細胞If電流升高或降低，而這可能與竇房結(jié)起搏活動效率下降及異位起搏點的產(chǎn)生有關，并可誘發(fā)致死性心律失常，這也是運動猝死的主要原因之一。

綜上，HCN通道介導的If作為“起搏電流”，在竇房結(jié)起搏活動的生成和調(diào)節(jié)中具有重要作用，兩周力竭游泳運動可導致大鼠竇房結(jié)HCN通道主要亞基HCN2和HCN4mRNA表達下降，以及If電流密度減小，可見，長時間高強度運動對HCN通道結(jié)構(gòu)組成及電生理活動的影響可能成為長期運動引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的主要離子通道機制之一。

4 總結(jié)

兩周力竭運動可引起竇房結(jié)HCN通道亞基HCN2及HCN4mRNA表達下降，If電流密度減小，這可能成為運動引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的離子通道機制之一。

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Effects of Exhaustive Exercise on the Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated Channels in Sinoatrial Node of Rat

Bo Bing1，2，Chang Yun2
1 Shanghaiuniversity of Sport，Shanghai，China 200438
2 China Institute of Sport Science，Beijing，China 100061

Chang Yun，Email：changyun2518@vip.sina.com

ObjectiveThis paper discusses the subunitmRNA and current density of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels（HCN channel）in sinoatrial node（SAN）at different time phrases after exhaustive exercise.Methods180 healthy adultmale SD rats were equally assigned into following 9 groups：1 control groups（C），4 single bout of exhaustive swimming groups（O），and 4 2-week repeated exhaustive swimming groups（R）.2-hour exhaustive swimming with 3%of body weight on their tails was carried out for groups R，6 days per week for a total of 2 weeks.After 2-week normal feeding，The same exhaustive swimming as for groups R was carried out for the groups O.The sampleswere drawn immediately，and at 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming.ThemRNA expression of HCN channel subunits in SAN in groups R were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR，and the current density of HCN channel by SAN cells isolation and whole-cell patch clamp.Results（1）The HCN1 and HCN4 mRNA expressions in group O immediate（P<0.05，P<0.01），especially 4 hours after swimming（P<0.01，P<0.05）were significantly higher than that in group C，and HCN2 and HCN4 mRNA expressions in groups R immediate and 4 hours after swimming were significantly lower than that in group C（P<0.01，P<0.01）.The HCN2 and HCN4 mRNA expressions in group R 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming decreased significantly（P<0.01）.（2）The current density of HCN channel in group R 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming were significantly lower than that in group C and in group O 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming（P<0.01）.ConclusionExhaustive exercise downregulated the SAN HCN2 and HCN4 mRNA expressions，along with the corresponding current If，and induced remolding of HCN channel，which could be one of the most important factors of exercise-induced sinoatrial node dysfunction.

exhaustive swimming，sinoatrial node，hyperpolarization-activated cyclic nucleotidegated，channels

2012.07.10

國家體育總局體育科學研究所基本科研業(yè)務經(jīng)費（10-01）

常蕓，Email：changyun2518@vip.sina.com，Tel：010-87182526