邱國榮徐曉陽謝敏豪

1 重慶文理學院體育學院（重慶永川 402160）

2 華南師范大學體育科學學院

3北京體育大學運動人體科學學院

電刺激引起C2C12肌管IL-6蛋白及IL-6、GLUT4基因表達的變化

邱國榮1徐曉陽2謝敏豪3

1 重慶文理學院體育學院（重慶永川 402160）

2 華南師范大學體育科學學院

3北京體育大學運動人體科學學院

目的：研究骨骼肌細胞在不同時間的電刺激下產(chǎn)生的GLUT4基因與肌源性IL-6蛋白含量及其基因表達之間的關(guān)系。方法：以小鼠骨骼肌肌母細胞（C2C12）為研究對象，分為電刺激組和對照組。分別測定當刺激時間為45 min、60 min、75 min、90 min及120 min時C2C12肌管內(nèi)糖原含量、GLUT4和IL-6mRNA表達以及C2C12肌管上清液IL-6含量。結(jié)果：（1）電刺激各組GLUT4mRNA表達均有所增加，其中60min、75min和120min組顯著高于對照組（P<0.05）；電刺激75min和120min組IL-6 mRNA表達顯著高于對照組 （P<0.05）；電刺激各組上清液IL-6含量均顯著高于對照組 （P< 0.05）。（2）隨電刺激時間增加，上述各項指標均先增加，后下降，90min時達低谷。（3）隨電刺激時間延長，C2C12肌管糖原含量逐漸減少，其中，刺激120分鐘組糖原含量與對照組相比顯著減少 （P< 0.05）。結(jié)論：（1）電刺激C2C12肌管對細胞糖代謝產(chǎn)生了一定影響；（2）電刺激C2C12肌管引起的GLUT4mRNA表達的增加很可能與肌管收縮產(chǎn)生的IL-6有關(guān)。

C2C12肌管；電刺激；IL-6蛋白含量；GLUT4基因表達；IL-6基因表達

在近期研究中，骨骼肌被認為是一個內(nèi)分泌器官，分泌和表達許多種細胞因子。其中，最先被發(fā)現(xiàn)、也是在運動中被研究最多的細胞因子是白介素6（IL-6）［1］。先前研究發(fā)現(xiàn)，肌源性IL-6在新陳代謝中起著重要作用，運動中其與葡萄糖代謝關(guān)系密切［2］。葡萄糖轉(zhuǎn)運載體（Glucose transporters，GLUT）是葡萄糖進入細胞的介導物質(zhì)，其中GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運是骨骼肌中糖代謝的主要限速步驟，在葡萄糖代謝中起著重要作用。目前，關(guān)于運動中肌源性IL-6在葡萄糖代謝中所起的具體作用尚無定論。

電刺激是生理學常用的實驗方法，前人研究發(fā)現(xiàn)，利用電刺激方法可迅速改變C2C12細胞的基因表達［3］，增加活性氧分泌［4］，并引起參與線粒體生物合成的一些蛋白的表達［5］，這些與骨骼肌運動早期的適應性反應一致。本實驗以分化的C2C12肌管為研究對象，通過低頻電刺激模擬運動時神經(jīng)沖動，觀察在離體狀態(tài)下細胞肌源性IL-6與GLUT4基因在電刺激下的變化規(guī)律，研究肌源性IL-6與葡萄糖代謝之間的關(guān)系，為運動訓練實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 C2C12細胞培養(yǎng)

小鼠骨骼肌肌母細胞系C2C12細胞購自南方醫(yī)科大學解剖學教研室，保存于液氮。復蘇后培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱（FormaScientific，美國）中。當細胞生長至匯合度為70～80%時，將所有細胞用0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）消化后，以2×105/ml傳入3.5 cm培養(yǎng)皿中。大約培養(yǎng)2天后，細胞長滿皿底，將DMEM高糖培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基，隔天換液1次，分化5天后進行實驗。本實驗在華南師范大學體育科學學院實驗室完成。

1.2 實驗分組和電刺激方式

將培養(yǎng)細胞分為實驗組和對照組。實驗組根據(jù)電刺激時間分為30、45、60、75、90、120min組，用TYC型電刺激器（成都儀器廠）電刺激分化5天的肌管，強度為45V、20ms，5 Hz。對照組不刺激。

1.3 C2C12肌管糖原含量測定

采用蒽酮法，利用肌糖原/肝糖原測定試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）測定C2C12肌管糖原含量。電刺激后，收集細胞，將加堿液的細胞懸液收集入玻璃試管，放入100℃水浴鍋中煮20 min，后流水冷卻。按照試劑盒說明書配制顯色液。先用1 mg/ml葡萄糖原液做標準曲線，再將水煮過的糖原取50μl，加入1ml顯色液，混勻后置沸水中煮5min，冷卻后置于Model 550型酶標儀（日本BIO-RAD公司），570 nm波長、空白孔調(diào)零，測各管OD值。

1.4 IL-6mRNA和GLUT4mRNA表達測定

使用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測細胞IL-6 mRNA和GLUT4mRNA。電刺激細胞后即刻，在冰面用RNAiso Plus總RNA提取試劑（TaKaRa公司）抽提細胞總RNA，提取方法嚴格按照說明書進行。用紫外分光光度計測RNA在A260/A280的吸光度值，計算RNA純度和含量，用反轉(zhuǎn)錄體系（Promega公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

IL-6 mRNA和GLUT4mRNA引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。IL-6mRNA序列［6］為上游引物5’-TCC AGCCAG TTG CCTTCTTGG-3’，下游引物5’-TCTGACAGTGCA TCA TCG CTG-3’。退火溫度：50℃，35個循環(huán)。GLUT4mRNA序列［7］為上游引物5’-GATGCCGTCGGG TTTCCA GCA-3’，下游引物5’-TGA GGG TGCCTTGTGGGA TGG-3’。退火溫度：63℃，33個循環(huán)。以β-actin cDNA引物序列作為內(nèi)參照，其序列為上游引物5’-CGTGAA AAG ATG ACC CAG ATC A-3’，下游引物5’-CAC AGC CTG GATGGC TACGT-3’。退火溫度：56℃，34個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增結(jié)果，用紫外數(shù)字成像系統(tǒng)（美國genus公司）掃描定性，并用SYNGENE成像系統(tǒng)照相保存。用條帶分析軟件bandscan5.0對電泳條帶進行分析，計算每個PCR擴增產(chǎn)物的亮度，計算每樣品的目的基因和參照基因β-actin的亮度比值。

1.5 C2C12肌管上清液IL-6濃度測定

采用小鼠IL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒 （武漢中美科技公司提供），在一次性電刺激后使用酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）測定C2C12肌管上清液IL-6含量。刺激后即刻收集細胞懸液，1000 g離心20 min，取細胞上清液進行檢測。嚴格按照說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，組間比較進行單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

圖1 電刺激引起IL-6mRNA表達電泳圖

2 結(jié)果

2.1 肌管糖原

由表1可知：隨電刺激時間延長，C2C12肌管糖原含量逐漸減少，其中，刺激120分鐘組糖原含量與對照組相比顯著減少（P<0.05）。

表1 電刺激引起C2C12肌管糖原變化

2.2 肌管IL-6mRNA表達

RT-PCR結(jié)果（圖1和表2）顯示，隨電刺激時間延長，C2C12肌管IL-6mRNA表達增加，其中刺激75分鐘組和120分鐘組與對照組相比均顯著增加 （P<0.05），兩組與刺激90分鐘組相比均顯著升高（P<0.01）。

表2 電刺激引起C2C12肌管IL-6mRNA表達變化

2.3 肌管GLUT4mRNA表達

RT-PCR結(jié)果（圖2和表3）顯示：隨電刺激時間延長，C2C12肌管GLUT4 mRNA表達增加，刺激60分鐘組、75分鐘組和120分鐘組GLUT4 mRNA表達與對照組相比明顯升高（P<0.05，P<0.01）。

表3 電刺激引起C2C12肌管GLUT4m RNA表達變化

圖2 電刺激引起GLUT4m RNA表達電泳圖

2.4 肌管上清液IL-6濃度

表4 電刺激引起C2C12肌管上清液IL-6濃度變化

由表4可見：隨電刺激時間延長，C2C12肌管上清液IL-6濃度升高，各刺激組與對照組相比均顯著升高（P<0.05），其中刺激60分鐘組、75分鐘組和120分鐘組IL-6濃度與刺激90分鐘組相比明顯升高（P<0.05）。

3 討論

3.1 電刺激對C2C12肌管GLUT4mRNA表達的影響

葡萄糖作為能量物質(zhì)，在運動中發(fā)揮著舉足輕重的作用。但葡萄糖是一種極性分子，不能以自由擴散的方式通過細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的疏水端，需要借助于細胞膜上的GLUT的介導進入細胞內(nèi)。迄今為止，在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)6種GLUT，分別是GLUT1-5和GLUT7。其中GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運是骨骼肌糖代謝的主要限速步驟。胰島素和肌肉收縮是已知的生理狀態(tài)下促使GLUT4轉(zhuǎn)位的兩個主要因素［8］。

Goodyear等［9］早在1990年就發(fā)現(xiàn)，在運動后的恢復早期，骨骼肌細胞對葡萄糖的通透性增加是通過增加細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運載體和其內(nèi)在活性所致。Ren等［10］發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運能力與葡萄糖轉(zhuǎn)運載體數(shù)量有密切聯(lián)系，并認為運動中GLUT4的快速增加是肌肉對運動進行適應的早期表現(xiàn)，可以更多地增加肌糖原儲備的補充。Neufer等［11］發(fā)現(xiàn)，一次性運動后，肌肉GLUT4mRNA表達增加，GLUT4蛋白在1周訓練后也隨之增加。研究者認為，GLUT4蛋白表達的增加受到轉(zhuǎn)錄和翻譯的共同調(diào)節(jié)作用。Marotta等［12］研究發(fā)現(xiàn)，一次性電刺激C2C12肌管90 min，可增加葡萄糖代謝和糖原分解能力，電刺激引起的骨骼肌肌管的收縮性與運動引起的相同，電刺激下發(fā)生的骨骼肌肌管的糖代謝變化與運動時骨骼肌的變化相同。

本研究中發(fā)現(xiàn)，電刺激C2C12肌管可增加GLUT4 mRNA表達，并且，隨著刺激時間的延長，GLUT4 mRNA表達呈規(guī)律性增加，當電刺激時間延長至60分鐘，75分鐘及90分鐘時，GLUT4mRNA表達顯著增加。同時，隨著電刺激時間延長，C2C12肌管糖原含量呈下降趨勢，且電刺激120 min時，糖原含量與對照組比較顯著減少。這與在體研究中隨著運動時間延長，糖原消耗明顯增加的結(jié)果相似［13］。這也與Marotta的研究結(jié)果［12］相似，說明電刺激模擬運動時神經(jīng)沖動的發(fā)放，使肌管產(chǎn)生收縮性，可以改變葡萄糖代謝的狀態(tài)，對葡萄糖轉(zhuǎn)運能力產(chǎn)生影響。

3.2 電刺激C2C12肌管產(chǎn)生的IL-6與葡萄糖代謝的關(guān)系

過去研究已經(jīng)證實，人和大鼠骨骼肌收縮能夠在循環(huán)系統(tǒng)中產(chǎn)生和釋放IL-6［14，15］。在運動中，肌纖維本身是產(chǎn)生IL-6的一種來源［16，17］。在運動中，血漿胰島素水平通常很低，骨骼肌需要增加葡萄糖和脂肪攝入來產(chǎn)生ATP和快速補充肝糖原儲備［18］。骨骼肌收縮產(chǎn)生的IL-6的一個生理功能，可能是增加葡萄糖在骨骼肌中的合成［19］。IL-6可以導致糖原分解，增加葡萄糖在肝臟中的輸出，并且在脂肪組織中增加脂解作用，這可能為骨骼肌提供葡萄糖和脂肪酸作為能源物質(zhì)［20］。在運動中產(chǎn)生的IL-6可能發(fā)揮一種胰島素敏感性效應，可以減弱肌肉中由胰島素分泌引起的葡萄糖增加的作用［21］。研究表明肌肉在運動時釋放大量IL-6，可能在維持運動中和運動后的葡萄糖動態(tài)平衡中起到?jīng)Q定性的作用［22］。

運動中肌源性IL-6的產(chǎn)生與葡萄糖代謝之間的關(guān)系非常緊密，但IL-6通過何種途徑影響葡萄糖代謝目前尚無定論。Pedersen等［23］認為，肌源性IL-6可促進骨骼肌對葡萄糖的攝取能力，攝取能力的增加與增加GULT4基因表達和轉(zhuǎn)位能力相關(guān)。Carey等［21］通過在體試驗得出結(jié)論，IL-6通過增加GLUT4的轉(zhuǎn)錄而增加基礎(chǔ)水平和受到胰島素刺激時的葡萄糖攝取，同時，在此過程中，AMP-活性蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）起到關(guān)鍵作用。

本研究中，電刺激C2C12肌管后，GLUT4 mRNA表達呈增加趨勢，且隨著刺激時間的延長，增加趨勢呈現(xiàn)一定規(guī)律性，即電刺激75min和電刺激120min時表達量與對照組相比顯著增加，表達變化趨勢呈雙峰曲線。同時，電刺激引起C2C12肌管IL-6及IL-6 mRNA表達增加，兩者變化規(guī)律均呈雙峰曲線，峰值分別出現(xiàn)在電刺激75分鐘和電刺激120分鐘，這種變化與電刺激引起的GLUT4 mRNA的變化規(guī)律一致。總結(jié)前人研究可知，在運動中，IL-6的一種生物學功能可能是引起機體葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)運增加的一個信號。我們猜測，可能是IL-6的自分泌作用在一定程度上增加了GLUT4基因的表達。雖然無直接證據(jù)證明這種猜想，但根據(jù)電刺激模擬運動中神經(jīng)沖動發(fā)放過程中產(chǎn)生不同濃度IL-6時，GLUT4基因表達變化趨勢與IL-6蛋白合成和基因表達呈一致性這一事實，證明它們之間是存在聯(lián)系的，研究觀察到的GLUT4mRNA表達的變化可能是電刺激產(chǎn)生的肌源性IL-6引起的。但IL-6通過何種途徑對葡萄糖代謝產(chǎn)生影響，將是今后研究繼續(xù)關(guān)注的重點。

4 總結(jié)

電刺激C2C12肌管對細胞糖代謝產(chǎn)生了一定影響，電刺激C2C12肌管引起的GLUT4 mRNA的表達增加可能與肌管收縮產(chǎn)生的IL-6有關(guān)。

［1］Pedersen BK，F(xiàn)ebbraio MA.muscle as an endocrine organ：focus on muscle-derived interleukin-6.Physiol Rev，2008，88（4）：1379-1406.

［2］GleesonM.Interleukinsand exercise.JPhysiol，2000，529：1.

［3］Irrcher I，Hood DA.Regulation of Egr-1，SRF，and Sp1 mRNA expression in contracting skeletal muscle cells.J Appl Physiol，2004，97：2207-2213.

［4］潘紅英，徐曉陽，劉承宜，等，電刺激C2C12細胞時活性氧生成的變化.中國運動醫(yī)學雜志，2006，25（1）：46-49.

［5］Irrcher I，Adhihetty PJ，Sheehan T，et al.PPARγcoactivator-1αexpression during thyroid hormone-and contractile activity-induced mitochondrial adaptations.Am J Physiol Cell Physiol，2003，284（6）：C1669-1677.

［6］JovéM，Planavila A，Laguna JC，et al.Palmitate-induced interleukin 6 production is mediated by protein kinase C and nuclear-factorκB activation and leads to glucose transporter 4 down-regulation in skeletalmuscle cells.Endocrinology，2005，146（7）：3087-3095.

［7］JovéM，Planavila A，Sánchez RM，et al.Palmitate induces tumor necrosis factor-αexpression in C2C12 skeletalmuscle cells by a mechanism involving protein kinase C and nuclear factor-κB activation.Endocrinology，2006，147（1）：1552-1561.

［8］潘志軍.葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4與運動.中國體育科技，2006，42（2）：118-121.

［9］Goodyear LJ，Chang PY，Sherwood DJ，et al.Effects of exercise and insulin onmitogen-activated protein kinase signaling pathways in rat skeletal muscle.Am J Physiol，1996，271（2）：E403-E408.

［10］Ren JM，Semenkovich CF，Gulve EA，et al.Exercise induces rapid increases in GLUT4 expression，glucose transport capacity，and insulin-stimulated glycogen storage inmuscle.JBiol Chem，1994，269（20）：14396-14401.

［11］Neufer PD，Dohm GL.Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle.Am J Physiol Cell Physiol，1993，265：C1597-C1603.

［12］Marotta M，Bragós R，Gómez-Foix AM.Design and performance of an electrical stimulator for long-term contraction of cultured muscle cells.Biotechniques，2004，36（1）：68-73.

［13］Steensberg A,Febbraio MA,Osada T,et al.Interleukin-6 production in contracting human skeletalmuscle is influenced by pre-exercisemuscle glycogen content.JPhysiol, 2001,537（pt2）:633-639.

［14］Jonsdottir IH，Schjerling P，Ostrowski K，et al.Muscle contractions induce interleukin-6 mRNA production in rat skeletalmuscles.JPhysiol，2000，528（part1）：157-163.

［15］Febbraio MA，Ott P，Nielsen HB，et al.Hepatosplanchnic clearance of interleukin-6 in humans during exercise.Am JPhysiol EndocrinolMetab，2003，285（2）：E397-E402.

［16］Penkowa M，Keller C，Keller P，et al.Immunohistochemical detection of interleukin-6 in human skeletalmuscleWbers following exercise.FASEB J，2003，17（14）：2166-2168.

［17］Hiscock N，Chan MH，Bisucci T，et al.Skeletal myocytes are a source of interleukin-6 mRNA expression and protein release during contraction：evidence of fiber type specificity.FASEB J，2004，18（9）：992-994.

［18］Shulman RG，Rothman DL.The“glycogen shunt”in exercising muscle：A role for glycogen in muscle energetics and fatigue.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（2）：457-461.

［19］Febbraio MA，Pedersen BK.Muscle-derived interleukin-6：mechanisms for activation and possible biological roles.FASEB J，2002，16（11）：1335-1347.

［20］Weigert C，Hennige AM，Brodbeck K，et al.Interleukin-6 acts as insulin sensitizer on glycogen synthesis in human skeletalmuscle cells by phosphorylation of Ser473 of Akt.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，289 （2）：E251-E257.

［21］Carey AL，Steinberg GR，Macaulay SL，et al.Interleukin-6 increases insulin-stimulated glucose disposal in humans and glucose uptake and fatty acid oxidation in vitro via AMP-activated protein kinase.Diabetes，2006，55（10）：2688-2697.

［22］Lopez-Soriano J，Chiellini C，Maffei M，et al.Roles of skeletalmuscle and peroxisome proliferator-activated receptors in the development and treatment of obesity.Endocr Rev，2006，27（3）：318-329.

［23］Pedersen BK，Steensberg A，Schjerling P.Muscle-derived interleukin-6：possible biological effects.J Physiol，2001，536（pt2）：329-337.

Changes in IL-6 Content，and IL-6 and GLUT4 Gene Expressions of C2C12M yotubule Caused by Electrical Stimulation

Qiu Guorong1，Xu Xiaoyang2，Xie Minhao3
1 Chongqing University of Arts and Science，Yongchuan，China 402160
2 South China Normal University，Guangzhou，China 510006
3 Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing，China 100086

Xie Minhao，Email：xieminhao@bsu.edu.cn

ObjectiveIn this study，the relationship among GLUT4 mRNA expression，contents of myogenic IL-6，and its mRNA expressions following different durations of electrical stimulation were researched.MethodsC2C12 cellswere divided into electrical stimulation group（ES）and control group（CON）.GLUT4 mRNA，IL-6 mRNA expression in C2C12 myotubes and the contents of IL-6 in C2C12 myotubes were determined following different stimulation durations.Results（1）With prolonging of stimulation duration，the GLUT4 mRNA expression in C2C12 myotubes increased.Compared with the group CON，the GLUT4 mRNA expression following 60-minute，75-minute and 120-minute stimulation increased significantly（P<0.05），the IL-6mRNA expression in C2C12myotubes increased significantly following 75-minute and 120-minute stimulation（P<0.05），the IL-6 concentration in supernatant increased（P<0.05）in group ES，and the IL-6 concentration of group ES following the three durations was significantly higher than of group CON （P<0.05）.（2）With prolonging of stimulation duration，allparameters increased at first，then gradually decreased to the lowest values after 90-minute stimulation.（3）With prolonging of stimulation duration，the glycogen content in C2C12 myotubes gradually decreased，and was significantly differed from group CON following 120-minute stimulation（P<0.05）.Conclusions（1）Electrical stimulation affected glucose metabolism of cells to some extent.（2）The change in GULT4 mRNA expression in C2C12 myotubes was correlated positively with the change in protein level and gene level of IL-6 following electrical stimulation.

C2C12 myotube，electrical stimulation，IL-6 protein content，GLUT4 gene expression，IL-6 gene expression

2012.04.07

國家自然科學基金（30570897）資助

謝敏豪，Email：xieminhao@bsu.edu.cn