于新迪，王震宇，丁 雷，莫 茜，朱德明，王 偉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心 心胸外科體外循環(huán)科 兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，上海 200127)

大鼠肢端缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血后炎癥反應(yīng)的影響

于新迪，王震宇，丁 雷，莫 茜，朱德明，王 偉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心 心胸外科體外循環(huán)科 兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，上海 200127)

目的 通過觀察肢端缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning，LIP)對(duì)大鼠腦缺血性損傷后重要炎癥因子表達(dá)的影響，探討LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。方法 選取72只SD大鼠，實(shí)驗(yàn)組(LIP組)30只、缺血組30只和對(duì)照組12只。實(shí)驗(yàn)組和缺血組設(shè)立5個(gè)時(shí)間點(diǎn):6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，每點(diǎn)6只。通過線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的局灶性腦缺血模型及LIP法建立腦缺血耐受模型，采用HE觀察每組大鼠的腦組織形態(tài)學(xué)改變、QRT－PCR和ELISA方法檢測腦組織中炎癥因子IL－17及IL－6的表達(dá)變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組腦組織學(xué)病理改變明顯輕于缺血組。與缺血組相比:實(shí)驗(yàn)組的IL－17和IL－6的基因和蛋白表達(dá)在整體水平均呈下降趨勢(shì);mRNA水平提示實(shí)驗(yàn)組在缺血12 h、24 h和48 h后腦組織中IL－17、IL－6的表達(dá)量顯著減少(P＜0.01);蛋白水平提示實(shí)驗(yàn)組在缺血24 h和48 h后腦組織中的IL－6以及在缺血12 h、24 h和48 h后腦組織中IL－17的表達(dá)量均降低(P＜0.05)。結(jié)論 LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受，可以減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血性腦損傷有一定的保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng);神經(jīng)系統(tǒng);腦損傷;肢端缺血預(yù)處理;缺血耐受

腦缺血損傷主要是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的復(fù)雜的病理過程，其中炎癥因子的分泌和炎性細(xì)胞的浸潤在這一損傷過程中發(fā)揮極為重要的作用。缺血耐受(ischemic tolerance，IT)是指組織經(jīng)過一次或多次短暫性缺血復(fù)灌后所誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，能對(duì)以后較長時(shí)間的缺血損傷產(chǎn)生顯著的耐受作用，在一定程度上減輕再次缺血所引起的損傷，該現(xiàn)象稱為缺血預(yù)處理，其具體機(jī)制目前尚不明確［1］。IT的保護(hù)作用也存在于不同的器官之間，如肢體、小腸和腎臟等器官的缺血預(yù)處理也可對(duì)隨后缺血的心、肝等器官產(chǎn)生保護(hù)作用［2］，這種現(xiàn)象已經(jīng)在心肌缺血損傷中得到了證實(shí)［3］，但由于血腦屏障的存在，該方法是否對(duì)腦缺血性損傷有保護(hù)作用尚未被廣泛證實(shí)。因此，本研究探討肢端缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning，LIP)和腦缺血損傷的關(guān)系，以了解LIP在腦損傷中能否發(fā)揮保護(hù)作用以及LIP對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用清潔級(jí)健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠72只(體重200士20 g)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007－0005，使用許可證號(hào):SYXK(滬)2003－0026。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:Trizol(Invitrogen)，RNA Later液(Ambion)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500，Promega)，PCR 試劑盒 (DRR041A，TAKARA)，白細(xì)胞介素 17(interleukin－17，IL－17)ELISA 試劑盒(MRK0016)，白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)ELISA試劑盒(MRK0004)，ProteaseInhibitorCocktail(P8340，Sigma Aldrich)，DEPC(Sigma Aldrich)，10% 水合氯醛［0.035mL/(kg體重)·次］，10%中性福爾馬林緩沖液。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器:A4級(jí)栓線(北京沙東生物有限公司)，7000實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(ABI，美國)，高速冷凍離心機(jī)(德國)，酶標(biāo)儀，恒溫箱，冷藏冷凍箱等。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)和 LIP模型

采用改良的 Longa［4］線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO模型，即分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，同時(shí)用無菌線栓栓塞其頸內(nèi)動(dòng)脈約18mm。將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組、缺血組和假手術(shù)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和缺血組均設(shè)立5個(gè)時(shí)間點(diǎn):6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。實(shí)驗(yàn)組采用LIP使肢體右側(cè)股動(dòng)脈缺血6 min/再灌注6 min 3個(gè)循環(huán)，24 h后建立MCAO模型。缺血組僅將右側(cè)股動(dòng)脈暴露相同時(shí)間，24 h后行MCAO。兩組的假手術(shù)對(duì)照組僅暴露相同部位的解剖結(jié)構(gòu)，但不進(jìn)行頸部線栓或肢端股動(dòng)脈夾閉，每組6只。對(duì)照組于術(shù)后即刻、實(shí)驗(yàn)組和缺血組于術(shù)后缺血對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予水合氯醛麻醉斷顱取腦，用于蘇木素－伊紅(hematoxylin and eosin，H＆E)染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(real－time quantitative PCR，QRT－PCR)和酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)檢測主要炎癥因子的表達(dá)。

1.2.2 HE染色

取實(shí)驗(yàn)組、缺血組和對(duì)照組腦組織的石蠟切片，丙酮固定1～2 min后蒸餾水洗，再逐次經(jīng)過蘇木素染色5～10 min，1%鹽酸乙醇分化30s，5%淡氨水返藍(lán)2 min，伊紅乙醇浸染3 min，以上各步操作后均經(jīng)過水洗。脫水透明封片后在光鏡下觀察腦組織的病理學(xué)改變。

1.2.3 QRT－PCR

按照Trizol試劑盒提供的方法提取每組腦組織細(xì)胞總 RNA，每個(gè)樣品加入1mL Trizol后研磨，經(jīng)氯仿、異丙醇和乙醇純化后的 RNA用 DEPC水溶解。分別取1 uLRNA和隨機(jī)引物，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(20 uL體系)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。取2 uL cDNA用SYBR GREEN PCR試劑盒(50 uL體系)，按照兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序在ABI prism 7000 Sequence Detection System上擴(kuò)增，首先50℃反應(yīng)10 s;階段1是預(yù)變性階段，95℃反應(yīng)30 s，1個(gè)循環(huán);階段2是PCR 反應(yīng)階段，95℃ 反應(yīng)5 s，然后60℃ 反應(yīng)31 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。引物按照Genebank所提供的基因序列采用Primer－5程序設(shè)計(jì)引物后由上海生工公司合成:

得到的 CT 值通過 2－ΔΔCT公式計(jì)算不同組中 IL－17和 IL－6的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA

所有腦組織經(jīng)勻漿后離心取上清按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。利用標(biāo)準(zhǔn)品建立 IL－17和IL－6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)板中加入待測樣品后在37℃孵育120 min;對(duì)應(yīng)的加第一抗體工作液后在37℃孵育60 min;加酶標(biāo)抗體工作液后在37℃孵育30 min;以上各步操作后酶標(biāo)板均經(jīng)過充分洗滌6次。加底物工作液后37℃暗處孵育15 min;加終止液后30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS(13.0版)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示。計(jì)量資料的組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異。

圖2 缺血組和實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中IL－17和IL－6 mRNA的表達(dá)水平(±s)Fig.2 IL－17 and IL－6 mRNA expressions of the cortex in ischemic group and experimental group after ischemia at different time points(±s)

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變

肉眼觀察缺血組大鼠缺血側(cè)腦半球明顯腫脹，實(shí)驗(yàn)組較缺血組腫脹程度略有減輕，對(duì)照組腦組織形態(tài)均正常。光鏡下觀察HE染色的腦組織切片，對(duì)照組均未見明顯病理改變(彩插1圖1A，G)。缺血組梗死灶位于右側(cè)額頂背外側(cè)皮質(zhì)和紋狀體等區(qū)域，呈片狀分布，病理改變最明顯:缺血組在缺血6 h及12 h后，可見皮層和基底核外側(cè)區(qū)腦組織呈現(xiàn)明顯水腫、血管周圍腔隙增寬(彩插1圖1B，C);缺血24 h及48 h后可見皮質(zhì)和基底核區(qū)液化壞死灶和液化空泡增多、組織間隙嚴(yán)重水腫，同時(shí)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(彩插1圖1D，E);缺血72 h后可見海馬區(qū)損傷嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞喪失正常結(jié)構(gòu)、呈現(xiàn)細(xì)胞脫失、層次減少等表型(彩插1圖1F)。相比，實(shí)驗(yàn)組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)較缺血組腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的壞死灶數(shù)量有下降趨勢(shì)，梗死灶周圍固縮濃染的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，間隙水腫程度也明顯減輕(彩插1圖1H－L)，提示LIP預(yù)處理可以明顯減輕缺血引起的腦組織損傷。

2.2 QRT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)缺血組、實(shí)驗(yàn)組腦組織中炎癥因子的表達(dá)

從圖2看出實(shí)驗(yàn)組和缺血組相比，IL－17和IL－6的整體水平呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組中12 h、24 h和48 h腦組織中 IL－17的表達(dá)明顯低于缺血組(P＜0.05)，其中 12 h和 24 h中 IL－17的降低更明顯。實(shí)驗(yàn)組中12 h、24 h和48 h腦組織中IL－6的表達(dá)顯著低于缺血組(P ＜0.01)。而 IL－17、IL－6 在 6 h 和72 h點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 ELISA檢測不同時(shí)間點(diǎn)缺血組、實(shí)驗(yàn)組腦組織炎癥因子的表達(dá)

從圖3看出缺血組和實(shí)驗(yàn)組的 IL－17和 IL－6的表達(dá)量在12 h、24 h、48 h和72 h均明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和缺血組相比，IL－17和 IL－6的表達(dá)在整體水平都有所降低。實(shí)驗(yàn)組中IL－17的表達(dá)量在12 h、24 h和 48 h明顯低于缺血組(P＜0.05)，而IL－6的表達(dá)量僅在24h和48h顯著低于缺血組(P＜0.05)。

圖3 對(duì)照組、缺血組和實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中IL－17和IL－6蛋白的表達(dá)水平(±s)Fig.3 IL－17 and IL－6 protein levels of the cortex in control group，ischemic group and experimental group after ischemia at different time points(±s)

3 討論

缺血性腦損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見病和多發(fā)病，其致殘率和致死率均較高［5］，引起眾多學(xué)者的關(guān)注以尋求治療的新方法。1990年 Kitagawa［6］等發(fā)現(xiàn)全腦一次短暫缺血即缺血預(yù)處理并未引起明顯的腦神經(jīng)損傷，且對(duì)再次致死性缺血損傷產(chǎn)生了明顯的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用即為 IT，這一現(xiàn)象立即引起了廣泛關(guān)注。隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)通過其它方法如:輕度低氧［7］、低溫、高壓氧和肢端缺血等也可以誘導(dǎo)腦IT，雖其確切機(jī)制仍不清楚，但炎癥、細(xì)胞因子及凋亡的上調(diào)被認(rèn)為在缺血導(dǎo)致的腦損傷中起重要作用［8］，目前推測非致死性預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受通過減輕上述反應(yīng)而減少損傷，然而缺血預(yù)處理對(duì)某些細(xì)胞因子表達(dá)的具體效應(yīng)尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將在LIP模型上研究缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血后炎癥反應(yīng)的影響。

IL－17作為一種新近發(fā)現(xiàn)的致炎性細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌IL－6、IL－8、單核細(xì)胞趨化蛋白－1和細(xì)胞間黏附分子1等炎性介質(zhì)［9］。IL－6是一種多效的細(xì)胞因子，是全身炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。幾乎所有的自身免疫性疾病、炎性疾病、外傷和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，都有 IL－6和IL－17的參與［10－12］。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞損傷和炎癥情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的 IL－6的來源，IL－6不僅可以促進(jìn)Th17的分化，還是IL－17重要的靶基因之一，且星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也存在IL－6正反饋調(diào)控通路［13］?，F(xiàn)在越來越多的研究報(bào)道了IL－17在腦組織中的表達(dá)，提示 IL－17可能在腦缺血的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮某種作用。有結(jié)果表明在動(dòng)物MCAO模型中，IL－17在腦缺血后1h就輕度增高，在缺血后第 6 d 達(dá)高峰［14］。Li等［15］采用原位雜交和免疫組化方法檢測大鼠腦缺血后 IL－17在腦中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL－17在腦缺血后腦內(nèi)表達(dá)從第1h到第6天逐漸增加，同時(shí)伴T細(xì)胞浸潤，并且與腦損傷面積呈正相關(guān)，表明IL－17和 T細(xì)胞參與腦損傷過程。本實(shí)驗(yàn)中缺血組結(jié)果與上述結(jié)果相似，表明 IL－17在缺血后6h即有表達(dá)，隨著缺血時(shí)間的延長至24h逐漸增多，尤其是在12 h至24 h表達(dá)增多的更明顯，隨后逐漸降低;IL－6表達(dá)的規(guī)律與IL－17基本相似，證實(shí)了IL－17及IL－6參與大鼠腦組織缺血后的損傷過程，介導(dǎo)相關(guān)的炎癥連鎖反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)LIP能夠誘導(dǎo)腦組織 IT，從而減輕腦部的炎癥反應(yīng)，而IT對(duì)其后腦缺血起到明顯的保護(hù)作用也許與IL－17和IL－6的表達(dá)減少有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)采用QRT－PCR和ELISA兩種方法從基因和蛋白層面來檢測 IL－17及 IL－6表達(dá)量的變化。mRNA水平顯示 IL－17及 IL－6的表達(dá)均隨缺血時(shí)間的延長而增多，在24h達(dá)到高峰后逐漸降低，而IL－6的增多更加顯著;實(shí)驗(yàn)組和缺血組與對(duì)照組相比IL－17及 IL－6的表達(dá)量均增加;實(shí)驗(yàn)組與缺血組相比IL－17 及 IL－6 在 12 h、24 h 和 48 h 的表達(dá)量均明顯減少。蛋白水平表明實(shí)驗(yàn)組與缺血組相比，IL－17在缺血后12 h、24 h和48 h的表達(dá)量有所減少且差異具有顯著性，而IL－6蛋白表達(dá)的減少在缺血后24 h和48 h更為明顯。本實(shí)驗(yàn)缺血后 IL－17和 IL－6的表達(dá)均有不同程度的增加，提示炎癥因子表達(dá)的增多加重神經(jīng)系統(tǒng)的損害，從而加重缺血局部的炎癥反應(yīng)。LIP后IL－17及IL－6的表達(dá)有所減少，提示缺血耐受激活了內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制使IL－17以及其誘導(dǎo)的其他因子如 IL－6的表達(dá)相應(yīng)減少，從而使 IL－6等對(duì)腦組織的損傷作用減輕，也表明 IL－17參與腦缺血損傷的同時(shí)也通過改變其他因素間接發(fā)揮了生物學(xué)效應(yīng)。

總之，本研究證實(shí)了LIP能夠誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生IT，通過減輕炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的腦損傷程度從而對(duì)腦缺血有保護(hù)作用。腦 IT使 IL－17及 IL－6的表達(dá)均減少，提示IL－17及 IL－6可能在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。因此，尋找新方法抑制 IL－17的表達(dá)或阻斷信號(hào)通路控制 IL－17的表達(dá)，減少其誘導(dǎo)的其他因子如IL－6從而達(dá)到減輕缺血后腦損傷的目的，可能會(huì)成為理論研究的新方向。

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The Effects of Limb Ischemic Preconditioning Pretreatment on the Inflammatory Response Induced by Cerebral Ischemia in Rats

YU Xin－di，WANG Zhen－yu，DING Lei，MO Xi，ZHU De－ming，WANG Wei
(Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，Shanghai Children＇s Medical Center，Shanghai Jiao Tong University，School of Medicine，Shanghai 200127，China)

Objective To investigate whether limb ischemic preconditioning(LIP)pretreatment has protective effects to the brain after cerebral ischemic injury by investigating the effects of LIP pretreatment on anti－inflammatory response in rats.Methods Seventy－two Sprague Dawley rats were divided into 3 groups:experimental group(n=30)，ischemic group(n=30)and control group(n=12).Six samples from five timepoints(6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after surgical manipulation)were collected for the experimental and ischemic groups，while other twelve animals were untreated and used as controls.The models with middle cerebral artery occlusion(MCAO)were obtained by thread blocking and the models with cerebral ischemic tolerance(IT)were obtained by LIP pretreatment.The determination of histopathological changes，real－time quantitative PCR(QTR－PCR)and enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)were used to observe the expression of interleukin－17(IL－17)and interleukin－6(IL－6).Results The pathological change in experimental group was not as obvious as ischemia group.The results of QRT－PCR demonstrated that the expression of IL－17 and IL－6 were reduced significantly in experimental group.Significant different in the expression of IL－17 and IL－6 were found between ischemia and experimental groups at 12 h、24 h and 48 h time points(P ＜ 0.01).The data of ELISA suggested that the expression of IL－17 and IL－6 were reduced obviously in experimental group.Significant different in the expression of IL－17 were found between ischemia and experimental groups at 12 h、24 h and 48h time points(P ＜ 0.05)，while significant different in the expression of IL－6 were at 24 h and 48 h time points(P ＜ 0.05).Conclusion LIP pretreatment could induce ischemic tolerance，probably by providing obviously anti－inflammatory effects and protective function for the followed ischemic injury.

Inflammatory response;Cerebral injury;Limb ischemic preconditioning;Ischemic tolerance

R332

A

1671－7856(2012)09－0008－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.001.002

2012－07－25

圖1 缺血組和實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織切片HE染色（×100）
Fig.1 HE staining of brain tissues from ischemic group and experimental group after ischemia at different time points （×100）

上海市科委項(xiàng)目資助(09411965200)。

于新迪，女(1985－)，住院醫(yī)師，研究生，研究方向:先心病圍術(shù)期臟器功能的保護(hù)。

王偉，Email:wangweicpb@gmail.com。