石桂英，白 琳，鞠振宇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

Cramp基因敲除對小鼠骨髓造血干細胞的影響

石桂英，白 琳，鞠振宇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 研究Cramp基因敲除在衰老過程中對小鼠造血干細胞的作用。方法 應(yīng)用流式細胞儀分析3月齡及12月齡Cramp基因敲除小鼠及同窩野生型小鼠的骨髓造血干細胞的比例及不同發(fā)育階段B淋巴細胞的比例。結(jié)果 與野生型小鼠相比，12月齡Cramp基因敲除小鼠的骨髓長期造血干細胞增多，多潛能造血祖細胞減少;前體B淋巴細胞和未成熟B淋巴細胞減少，成熟B淋巴細胞增多。結(jié)論 在衰老過程中，Cramp基因敲除對骨髓造血干細胞及B淋巴細胞發(fā)育有重要影響。

Cramp基因敲除小鼠;流式細胞術(shù);骨髓造血干細胞;B淋巴細胞

小鼠 Cramp蛋白是由 Gallo等［1］首先分離鑒定的，該類蛋白與之前在人、豬、牛、兔、羊等動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽前體，具有高度保守的區(qū)域即cathelin，因此，將這一大類抗菌肽命名為cathelicidins。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，還具有抑制組織損傷、促進創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié)合內(nèi)毒素、誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)功能。炎性衰老是目前國際衰老理論的研究熱點［2－4］，Cramp蛋白作為一種炎癥因子，在老齡短端粒模型小鼠中高表達，而正常老齡野生型小鼠中其表達量未見明顯升高［5］，該蛋白在衰老中的作用值得深入研究。為了進一步研究Cramp蛋白在衰老中的作用，我們從德國引進了Cramp基因敲除小鼠，對不同月齡的Cramp基因敲除小鼠和同齡野生型小鼠的骨髓細胞，應(yīng)用流式細胞儀分析了骨髓造血干細胞及不同發(fā)育階段B細胞的的比例。

1 材料和方法

1.1 Cramp基因敲除小鼠

該小鼠由德國引進，在本所繁育【SCXK(京)2009－0007;SYXK(京)2011－0022】。動物飼養(yǎng)在SPF動物房內(nèi)，分別在3月齡、12月齡時，脫頸椎處死小鼠進行實驗。

1.2 PCR方法鑒定Cramp基因敲除小鼠的基因型

用2周齡小鼠尾尖提取基因組DNA，普通PCR鑒定基因型。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán);72℃ 延伸 10 min?；蚯贸∈蟮?PCR鑒定引物:CRAMP 1A:5＇CCAGGGACTTCCATCCAGTAGAC 3＇，CRAMP 1B:5＇AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3＇，CRAMP2A:5＇TGTTTTCTCAGATCCTTGGGAGC 3＇，CRAMP 2B:5＇AATTTTCTTGAACCGAAAGGGC 3＇，PCR 產(chǎn)物長度，野生型為241 bp，CRAMP敲除為88 bp，雜合子同時有上述兩條片段。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，PCR試劑購自寶生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠脫頸椎處死后，取后肢骨，置于冰上預(yù)冷的染色緩沖液(含1%BSA的PBS)中，用5mL注射器將骨髓細胞沖出，并吹打成細胞懸液，將細胞懸液用50 μm尼龍濾膜過濾后收集到15mL離心管中，用 PBS定容至 10mL，混勻后，取 10 μL細胞懸液，稀釋10倍后計數(shù)細胞數(shù)。細胞懸液離心，1000 rpm，10 min，將細胞濃度調(diào)整為 1X108個細胞/mL。分別取106細胞標記熒光抗體(BD公司)。

骨髓造血干細胞的分析中用如下抗體進行標記:CD34－FITC、Flt3－PE、IL7R－Pcrcp－cy5.5、Sca1－PECy7、cKit－APC、Ter－119－Biotin、Gr－1－Biotin、Mac－1－Biotin、B220－Biotin、IL－7R－Biotin、CD4－Biotin、CD8－Biotin、Biotin－APC－Cy7。長期造血干細胞(LT－HSC)表面標記為 Lin－Sca1+cKit+CD34－Flt3－，短期造血干細 胞(ST－HSC)表面標記為 Lin－Sca1+cKit+CD34+Flt3－，多潛能造血祖細胞(MPP－HSC)表面標記為 Lin－Sca1+cKit+CD34+Flt3+。IgD－FITC、CD43－PE、B220－PE－Cy7、IgM－APC，標記不同發(fā)育階段的B淋巴細胞。前體B細胞(Pre B)表面標記為B220+CD43－IgD－IgM－，未成熟 B細胞表面標記為B220+CD43－IgD－IgM+，成熟 B細胞表面標記為B220+CD43－IgD+IgM+。上述抗體加入細胞懸液，冰上避光，30 min;加1mL染色緩沖液，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，加200 μL染色緩沖液重懸細胞，用50 μm尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。

1.4 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用±s表示。組間資料分析采用 t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cramp基因敲除小鼠基因型鑒定

為了建立Cramp基因敲除小鼠衰老研究隊列，我們應(yīng)用Cramp基因雜合小鼠配對繁殖，對子代小鼠進行基因型鑒定，保留Cramp基因敲除純合及同窩野生型小鼠?；蛐丸b定結(jié)果見圖1。

圖1 Cramp基因敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig.1 Genotyping of Cramp knockout mice

2.2 Cramp基因敲除對小鼠骨髓造血干細胞的影響

為了了解衰老過程中，Cramp基因敲除對小鼠骨髓造血干細胞的影響，我們分析了3月齡及12月齡Cramp基因敲除小鼠及同窩野生對照小鼠長期造血干細胞(LT－HSC)、短期造血干細胞(ST－HSC)、及多潛能造血祖細胞(MPP－HSC)的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，12月齡 Cramp基因敲除小鼠LT－HSC 顯著減少(P=0.0025，圖2A)，MPP－HSC 顯著增加(P=0.0073，圖2B)。

圖2 長期造血干細胞、多潛能造血祖細胞在骨髓LSK中的比例Fig.2 Percentage of LT－HSC、MPP－HSC in the bone marrow LSK cells

2.2 Cramp基因敲除對小鼠B淋巴細胞發(fā)育的影響

為了研究Cramp基因敲除在衰老過程中對小鼠B細胞發(fā)育的影響，我們分析了不同月齡Cramp基因敲除小鼠及同齡對照小鼠骨髓中不同發(fā)育階段的B淋巴細胞的比較，結(jié)果顯示，12月齡 Cramp基因敲除小鼠骨髓前體B淋巴細胞(P=0.02)和未成熟B淋巴細胞(P=0.0274)顯著減少，而成熟 B淋巴細胞(P=0.0002)顯著增加(圖3)。?

圖3 Cramp基因敲除對小鼠B淋巴細胞發(fā)育的影響Fig.3 Influences of Cramp gene knockout on mice B lymphocytes development

3 討論

隨著人口老齡化，關(guān)于衰老的研究成為國際研究熱點。衰老是全身系統(tǒng)性組織、器官功能退化，關(guān)于衰老已有多種假說，如端粒和端粒酶、炎性衰老等。已有研究發(fā)現(xiàn)，在端粒損傷衰老小鼠模型中，四種蛋白的表達量增加，其中包括 Cramp蛋白［4］，在人類相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，Cramp蛋白在人的血漿及各組織器官中的表達量增加，并且其表達量與端粒長度呈反比［6］，上述研究均表明Cramp蛋白是衰老過程中的一個重要生物標記物。Cramp蛋白在衰老過程中究竟有何作用，對造血系統(tǒng)有沒有影響，目前未見相關(guān)報道。

已有研究表明，在衰老過程中，小鼠骨髓造血干細胞數(shù)量增多，其中主要是增殖活化的造血干細胞數(shù)量增多［7，8，9］。但是，骨髓造血干細胞增殖活性提高，僅使造血干細胞數(shù)量增加，而不能增強其干細胞功能，生成淋巴細胞的能力降低，所以，老齡小鼠 B淋巴細胞及 T減少［7，8］。本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長，Cramp基因敲除后，骨髓長期造血干細胞(LTHSC)減少，而骨髓多潛能造血祖細胞(MPP－HSC)增多;同時，骨髓中前體B淋巴細胞和未成熟 B淋巴細胞減少，而成熟 B淋巴細胞增多。這說明Cramp基因在骨髓造血干細胞及B淋巴細胞發(fā)育及衰老中具有重要作用，其作用機制有待進一步深入研究。

［1］Gallo RL， Kim KJ， Bernfield M， et al. Identi fication of CRAMP，a cathelin－related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse［J］.J Biol Chem.1997;272:13088－13093.

［2］Franceschi C.Inflammaging as a major characteristic of old people:can it be prevented or cured?［J］.Nutrition reviews.［Review］.2007;65:S173－176.

［3］Goto M.Inflammaging(inflammation+aging):A driving force for human aging based on an evolutionarily antagonistic pleiotropy theory?［J］.Bioscience trends.［Review］.2008;2:218－230.

［4］Navarrete－Reyes AP，Montana－Alvarez M.Inflammaging.Aging in flammatory origin［J］. Revista de investigacion clinica.［Review］.2009;61:327－336.

［5］Jiang H，Schiffer E，Song Z，et al.Proteins induced by telomere dysfunction and DNA damage represent biomarkers of human aging and disease［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2008;105:11299－11304.

［6］Jiang H，Chen W，Qu L，et al.ELISA for aging biomarkers induced by telomere dysfunction in human plasma［J］.Journal of biomedicine＆biotechnology.2010;2010:121947.

［7］Rossi DJ，Bryder D，Zahn JM，Ahlenius H，Sonu R，Wagers AJ，et al.Cell intrinsic alterations underlie hematopoietic stem cell aging［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005;102:9194－9.

［8］Sudo K，Ema H， Morita Y， NakauchiH.Age－associated characteristics of murine hematopoietic stem cells［J］.Journal of Experimental Medicine 2000;192:1273－80.

［9］Chambers SM，Shaw CA，Gatza C，F(xiàn)isk CJ，Donehower LA，Goodell MA.Aging hematopoietic stem cells decline in function and exhibit epigenetic dysregulation［J］.PLoS Biology 2007;5:e201.

Influence of Cramp Knockout on the Function of Hematopoietic Stem Cell

SHI Gui－ying，BAI Lin，JU Zhen－yu
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆ Peking Union Medical College，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To study the influence of Cramp gene knockout on the function of hematopoietic stem cell in aging.Methods Cells from the bone marrow of different age Cramp knockout and wild type mice were analyzed by flow cytometry.Results Compared with 12 months old wild type mice，percentage of long term hematopoietic stem cell decreased，multipotent hematopoietic progenitor increased;percentages of pre B and immature B cells decreased，and mature B cells increased in Cramp knockout mice.Conclusion Cramp gene knockout plays an important role in hematopoietic stem cell and the development of B lymphocytes in aging.

Cramp knockout mouse;Flow cytometry;Hematopoietic stem cell;B lymphocyte

R332

A

1671－7856(2012)09－0013－03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.003

2012－08－25

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(DWS201010)。

石桂英，女，主管技師，研究方向:衰老與再生。

鞠振宇，E－mail:zhenyuju@hotmail.com。