毋 靜，梁婉怡，鄧家鑫，曲 源，于清宏

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣州 510280

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種常見的炎癥性疾病，它以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱慢性炎癥為主要表現(xiàn)。AS由于其低下的生活質(zhì)量和較高的致殘率而受到眾多關(guān)注。AS的治療仍然是全世界風(fēng)濕病學(xué)家面臨的難題，其難點(diǎn)之一是缺乏有效的治療藥物，傳統(tǒng)的改善病情抗風(fēng)濕藥物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs） 治療 AS 的療效有限，眾多風(fēng)濕病學(xué)專家也致力于新研究藥物的開發(fā)和應(yīng)用，以尋找更有效的抗炎藥物。Yokota等[1]研究表明他汀類藥物可下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者由TNF-a引起的IL-6 和IL-8 的增高。Nagashima等[2]研究顯示他汀類藥物可以促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞的凋亡，而且極有希望被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[3]。他汀類藥物已經(jīng)在臨床顯示出其有效的抗炎作用，由于此類藥物可以減弱脂多糖的作用，專家們認(rèn)為其是通過抑制天然免疫起作用的[4]。本研究通過觀察天然免疫分子 Toll樣受體 2（TLR-2）、Toll樣受體 4（TLR-4）在 AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的mRNA水平表達(dá)以及阿托伐他汀體外干預(yù)AS患者PBMC的研究，觀察Toll樣受體（TLRs）的表達(dá)差異，探討AS治療的可能的突破點(diǎn)，尋找新的治療AS的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

患者30例，其中，男27例，平均年齡30.6歲；女3例，平均年齡28.6歲，均為風(fēng)濕免疫科住院AS患者，將其作為AS患者組，均符合1984年修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，病情活動(dòng)期，得到患者同意后抽取肘靜脈血12 ml，EDTA抗凝，置4℃保存，另選取健康志愿者30例作為健康志愿者組，兩組年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。阿托伐他汀藥物原粉由北京紅惠公司贊助。RT-PCR引物由上海生物有限公司合成。

1.2 方法

①取4ml靜脈血緩慢加于淋巴細(xì)胞分離液上面，2000 r/min，離心20 min。用尖細(xì)玻璃管緩慢將分離到的中間層PBMC轉(zhuǎn)入離心管，PBS洗滌2次。離心管底可見白色沉淀，在沉淀中加1.0 ml的Trizol。反復(fù)抽吸勻漿液以剪切基因組DNA，將樣品轉(zhuǎn)移到無菌 1.5 ml離心管中，12 000 r/min，4℃，5 min。上清加入200 μl氯仿，劇烈振蕩混勻30 s。室溫放置5 min，12 000 r/min，4℃，10 min。重復(fù)上一步驟，吸取上清至另一1.5 ml離心管里加入等體積的異丙醇，混勻靜置數(shù)分鐘。12 000 r/min，4℃，離心10 min。 用70%酒精洗滌沉淀2次，真空離心干燥3～5 min，沉淀用30～50 μl DEPC-H2O溶解。取2.0 μl RNA樣品，紫外分光光度計(jì)A260 波長下測(cè)得RNA濃度，置-80℃保存。使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 TLR-4 引物，F(xiàn)orward primer （5′-3′）：5'-GAC CTG TCC CTG AAC CCT A-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-AAA TGT TGC CAT CCG AAA-3'； 擴(kuò)增產(chǎn)物 380 bp。TLR-2 引物，F(xiàn)orward primer（5′-3′）：5'-GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG-3'；Reverse primer （5′-3′）：5'-CTG AGC CTC GTC CAT GGG CCA CTC C-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物 639 bp。 β-actin引物，F(xiàn)orward primer（5′-3′）：5'-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3'；Reverse primer（5′-3′）：5'-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物為 592 bp。72℃，7 min，RT-PCR 32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳和電泳條帶分析：Labwork凝膠成像系統(tǒng)紫外光下成像分析，并應(yīng)用附帶軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin條帶吸光度值之比，進(jìn)行半定量分析。②取EDTA抗凝血4 ml加入等體積的PBS液稀釋并混勻，將稀釋的血液8 ml加入含有4 ml淋巴細(xì)胞分離液的15 ml離心管中，室溫下離心2 000 r/min，20 min。吸取交界處PBMC層并移入另一個(gè)15 ml離心管中；加入8 ml PBS混懸細(xì)胞；室溫下離心2 000 r/min。20 min，棄上清；用8 ml PBS再次混懸細(xì)胞，室溫下離心2 000 r/min，20 min，棄上清；用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液稀釋混懸細(xì)胞，分配至24 孔培養(yǎng)板，一份標(biāo)本轉(zhuǎn)入兩孔，使?jié)舛葹? ×106/孔，總體積為2 ml/孔，一孔用阿托伐他汀（終濃度為0.01 mmol/L）刺激，自身對(duì)照孔不予用藥，均在37℃CO2恒溫孵育箱為中連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，無菌EP管收集，離心后棄上清，留取細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及PCR擴(kuò)增（同上）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周單個(gè)核細(xì)胞TLR-2 和TLR-4 表達(dá)水平對(duì)比

①與健康志愿者組比較，AS患者組TLR-2 mRNA表達(dá)增高（圖1）。健康志愿者組TLR-2 mRNA表達(dá)水平為（0.06 ±0.39），AS 患者組 TLR-2 mRNA 表達(dá)水平為 （1.59 ±1.43），AS患者組與健康志愿者組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②與健康志愿者組比較，AS患者組TLR-4 mRNA表達(dá)增高（圖2）。 健康志愿者組TLR-4 mRNA表達(dá)水平為 （0.06 ±0.39），AS 患者組 TLR-4 mRNA 表達(dá)水平為 （0.60 ±0.73），AS患者組與健康志愿者組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 TLR-2 mRNA表達(dá)（1、2 為健康志愿者；3、4 為患者）

圖2 TLR-4 mRNA 表達(dá)（1、2 為健康志愿者；3、4、5 為患者）

2.2 阿托伐他汀干預(yù)對(duì)AS患者外周單個(gè)核細(xì)胞TLR-2 和TLR-4 表達(dá)水平的影響

①RT-PCR分析顯示，與空白對(duì)照組比較，阿托伐他汀干預(yù)組TLR-2 mRNA表達(dá)下降 （圖3）。阿托伐他汀干預(yù)組（0.59 ±0.44）和空白對(duì)照組（1.71 ±1.70）TLR-2 mRNA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02<0.05）。②與空白對(duì)照組比較，阿托伐他汀干預(yù)組TLR-4 mRNA表達(dá)下降（圖4）。阿托伐他汀干預(yù)組（0.25 ±0.25）和空白對(duì)照組（0.96 ±1.04）TLR-4 mRNA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 干預(yù)后TLR-2 mRNA表達(dá)（1 為對(duì)照組，2 為干預(yù)組）

圖4 干預(yù)后TLR-4 mRNA表達(dá)（1 為對(duì)照組，2 為干預(yù)組）

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病原因迄今未明，一般認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致，目前很多學(xué)者將強(qiáng)直性脊柱炎劃歸為自身免疫性疾病，其發(fā)病與患者自身的免疫失調(diào)有密切關(guān)系，患者往往存在免疫球蛋白、C反應(yīng)蛋白的顯著變化，除了確診標(biāo)志 HLA-B27 外，B7，B22，B40，BW42 等與 AS 也密切相關(guān)。Toll樣受體位于細(xì)胞膜上，是一種膜蛋白，在抵抗病原體的入侵，即在天然免疫中發(fā)揮重要作用，目前已知參與天然免疫的主要是TLR-2 和TLR-4。當(dāng)病原體及其產(chǎn)物與病原體的識(shí)別受體結(jié)合后，細(xì)胞即活化并釋放大量細(xì)胞因子或炎癥遞質(zhì)，參與天然和獲得性免疫的炎癥反應(yīng)[6]。TLR-4被活化后通過NF-κB途徑向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，可能由被修飾的脂蛋白引起[7]，脂蛋白可上調(diào)TLR-4 的表達(dá)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TLR-2 和TLR-4 與AS有密切的關(guān)系，AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于健康志愿者，提示TLR-2 和TLR-4可能參與AS的發(fā)病。

他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，被廣泛應(yīng)用于降低膽固醇和脂質(zhì)調(diào)節(jié)，但最近的研究表明，他汀類藥物有潛在的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作用。Van Wissen等[9]報(bào)道大樣本試驗(yàn)證實(shí)他汀類可降低C反應(yīng)蛋白的水平。他汀類藥物可以阻止巨噬細(xì)胞趨化因子的釋放，延緩趨化反應(yīng)和氧化反應(yīng)，降低NK細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性，抑制抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的體外激活，這些效應(yīng)提示天然免疫反應(yīng)易受HMG-CoA還原酶抑制劑的抑制[10]。Leung等[11]最近的研究顯示，辛伐他汀在體外能抑制滑膜T細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。Methe等[12]實(shí)驗(yàn)表明他汀可以下調(diào)由LPS刺激引起的TLR-4 的升高及其下游信號(hào)。他汀類藥物可以抑制核因子κB的表達(dá)和活性，從而影響趨化因子、黏附分子、血管壁中單核細(xì)胞趨化蛋白-1和其他炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。他汀類藥物有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，包括作用于各種免疫細(xì)胞（主要是單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞）的聚集、分化、增殖、分泌活動(dòng)。這些都表明他汀類藥物有非依賴降脂免疫調(diào)節(jié)的作用。這些發(fā)現(xiàn)為指示他汀類藥物可能作為一種新的免疫抑制劑提供了肯定的科學(xué)理論，本實(shí)驗(yàn)顯示阿托伐他汀可以抑制天然免疫的重要分子TLR-2、TLR-4 的表達(dá)，意味著阿托伐他汀可能作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于AS的治療。

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