馬 明 飛，李 樹 金，金 鳳 燮，魚 紅 閃

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引言

人參中的主要有效成分是人參皂苷［1］，但含量較高的皂苷成分不一定是活性最高且結構最佳的，而稀有皂苷含量極少，卻易被人體吸收，并且具有更高的生理活性。人參皂苷葡萄糖苷酶可以將人參中含量高的皂苷轉化為活性更高的微量成分皂苷。關于人參皂苷葡萄糖苷酶的報道，多來自于本實驗室，國內(nèi)外相關的研究較少。本實驗室長期研究能水解人參皂苷糖基的、特異的人參皂苷糖苷酶類［2］，并篩選出產(chǎn)人參皂苷葡萄糖苷酶的微生物Absidiasp.G8r，又對人參皂苷葡萄糖苷酶進行了分離、純化，并研究了其基本的酶學特性［3-4］。但是從分子生物學水平上研究人參皂苷葡萄糖苷酶基因的克隆和表達，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗室前期已成功從產(chǎn)人參皂苷葡萄糖苷酶的微生物Absidiasp.G8r菌中調取出了人參皂苷葡萄糖苷酶的基因全序列，全長為2 149bp，CDS區(qū)全長為1 923bp，共編碼640個氨基酸，理論分子質量約為71ku［5］。本實驗將編碼人參皂苷葡萄糖苷酶成熟肽的cDNA 片段克隆到大腸桿菌表達載體pET32a（+）中，構建了含有人參皂苷葡萄糖苷酶基因的重組質粒。將該重組質粒轉化至E.coliBL21（DE3），通過對重組蛋白進行變性、復性處理，進行了薄層層析法和SDSPAGE 法的定性和定量分析，進一步確定了所調取的人參皂苷葡萄糖苷酶基因序列的正確性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質粒E.coliBL21（DE3）和pET32a（+），購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 試劑與工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶、低分子質量蛋白Marker、Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、Takara DNA Ligation Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司。IPTG 購自北京欣經(jīng)科技生物技術有限公司。

1.1.3 儀器與設備

HimacCF15R 型高速冷凍離心機，JM-250型電泳儀，2816 型快速離心機，UV-120-02 型分光光度計，SK-1型快速混勻器，BCD-272AY 型容聲冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因的擴增

根據(jù)Genbank中人參皂苷葡萄糖苷酶基因序列，設計引物（CTC747F：5′-GAATTCGAGGCGCACGCTGGGAGAACA-3′；CTC747 R：5′-AAGCTTCTACTTCAGAGACAGCCAGGAGA-3′）。使用High Fidelity PrimeScriptTMRTPCR Kit進行RT-PCR。PCR 循環(huán)參數(shù)為：94 ℃3min；98 ℃10s，55 ℃15s，72 ℃2 min，進行30個循環(huán)；72℃10min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的基因，回收純化目的條帶，與載體pMD19-T Simple Vector連接后，將重組質粒熱轉化至E.coliCompetent Cells JM109 中，涂布于LB 平板，在37 ℃條件下過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落，提取質粒測序。

1.2.2 載體與目的片段的酶切與回收

使用EcoRⅠ和NotⅠ對pET32a（+）表達載體及目的片段進行雙酶切，酶切后分別作為載體和DNA 插入片段。采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0切膠回收載體以及目的片段，分別取1μL進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 連接與轉化

使用TaKaRa DNA Ligation Kit試劑盒中的連接酶，連接酶切后的載體和目的片段后，熱轉化至E.coliCompetent Cells JM109 中；重組體涂布于LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取質粒進行雙酶切鑒定以確認目的片段是否插入。將陽性的重組質粒熱轉化至宿主細胞E.coliCompetent Cells BL21（DE3）中，重組體涂布LB平板，于37 ℃過夜培養(yǎng)。提取陽性菌落的質粒進行雙酶切，對其進行鑒定。

1.2.4 目的蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

挑取陽性重組質粒，于含100μg/mL Amp的TB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下振蕩過夜培養(yǎng)。次日以1∶50的比例進行稀釋擴培，在37℃振蕩條件下培養(yǎng)至OD600達到0.6～1.0后，加入誘導劑IPTG（最終濃度為0.5 mmol/L），在30 ℃誘導培養(yǎng)4h。對重組蛋白進行SDS-PAGE檢測，以確定是否表達。

1.2.5 表達產(chǎn)物的變性和復性

4 ℃、10 000r/min離心15min，收集誘導后表達菌體，將其重懸于PBS（pH 7.4）緩沖液中，4 ℃、10 000r/min離心15min洗滌兩次。向清洗后的沉淀中加入10mL 細胞裂解液，48μL 溶菌酶（至100μg/mL），0.1%TritonX-100 50μL，室溫下靜置30 min。然后在冰浴條件下進行超聲裂解，至不再黏稠。超聲條件為：功率300 W，超聲2s，靜置5s。4 ℃、10 000r/min 離心15min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE 檢測，沉淀為以包涵體形式表達的目的蛋白。

將包涵體溶解于pH 7.5的8mol/L 尿素溶液中，在室溫下振蕩1h 以充分溶解包涵體。4 ℃、12 000r/min 離心15 min，將上清液以1∶40的比例稀釋到復性液（pH 7.5，5% 甘油，500μg/mL PEG，20μg/mL NaCl，0.035%β-巰基乙醇）中，4 ℃下攪拌1h，然后4 ℃下過夜復性。復性后離心，復性液與0.05%的Rb1溶液按體積比1∶1混勻，在40 ℃下反應24h后，加入飽和正丁醇終止反應，進行TLC活性檢測。

2 結果與討論

2.1 目的基因的擴增及載體與目的片段的酶切鑒定

經(jīng)PCR 得到了長度約為1.9kb 的擴增產(chǎn)物，與預期大小一致。采用“1.2.1”的方法對載體與目的片段進行酶切與回收，取1μL 進行3%瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖1所示。

pET32a（+）經(jīng)雙酶切后的大小與理論值相符，約5.9kb，結果見圖2。插入片段經(jīng)雙酶切后與目的基因全長大致相符，約為1.9kb，證明PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后為目的片段，可進一步將酶切目的蛋白和酶切載體進行連接。

圖1 PCR 擴增目的基因序列Fig.1 Amplification of insert DNA by PCR

圖2 目的片段與載體的酶切結果Fig.2 Insert DNA and vector digested with enzymes

2.2 重組質粒的構建與酶切鑒定

酶切載體和酶切目的片段經(jīng)連接酶連接后，熱轉化至E.coliCompetent Cells JM109 中，將熱轉化后的重組體涂布于LB平板，在37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。挑取陽性菌落，提取質粒進行雙酶切后，取1μL 進行3%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。

圖3 重組質粒的酶切電泳圖Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasmid digested with enzymes

泳道1 相對應的pET32a（+）載體片段為5.9kb的；泳道3 為1.9kb 的插入DNA片段。泳道2為重組質粒經(jīng)雙酶切后的結果，重組質粒由一個大小約5.9kb的pET32a（+）載體片段和1.9kb的目的基因片段組成。酶切鑒定結果表明目的片段已經(jīng)插入，重組質粒構建成功。

2.3 重組質粒轉入宿主菌

陽性重組質粒熱轉化至E.coliCompetent Cells BL21（DE3）中，重組體接種于LB 平板上，于37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。挑取陽性菌落的質粒進行雙酶切鑒定。片段大小與預期一致，表明外源基因已穩(wěn)定地整合入大腸桿菌中。結果如圖4所示。

圖4 重組轉化子的酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis of recombinant digested with enzymes

2.4 人參皂苷葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中的誘導表達

重組菌經(jīng)誘導表達后，進行SDS-PAGE 檢測。如圖5 所示，結果顯示經(jīng)過誘導的樣品在75ku有一條差異條帶，其分子質量與理論值基本相符，證明了重組蛋白在大腸桿菌中得到表達。對菌體進行細胞裂解、離心后分別將上清和沉淀部分進行SDS-PAGE檢測。從圖5中可看出，于上清液中并未檢測到目的蛋白，而在沉淀中發(fā)現(xiàn)有目的蛋白存在，說明該目的蛋白以包涵體形式表達。

圖5 重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

2.5 包涵體的變性和復性以及酶活性檢測

采用“1.2.4”的方法對包涵體進行變性和復性處理后得到重組蛋白，對其進行TLC 活性檢測。經(jīng)過變性和復性處理后的樣品能夠水解底物Rb1，說明其具有人參皂苷葡萄糖苷酶的活性。結果如圖6所示。

圖6 變復性后的薄層層析圖Fig.6 TLC of refolded inclusion body

3 結論

本實驗成功構建了含有人參皂苷葡萄糖苷酶基因的重組表達質粒并轉化至E.coliBL21（DE3），宿主菌經(jīng)IPTG 濃度誘導，產(chǎn)生了以包涵體形式表達的重組蛋白。通過對重組蛋白的SDS-PAGE分析，確定了表達的重組蛋白為人參皂苷葡萄糖苷酶。但是為了獲取有活性的重組蛋白，需要將包涵體中的重組蛋白變性溶解處理，然后進行稀釋復性處理，使重組蛋白分子重新折疊形成正確的空間結構。本實驗對復性方法和變性劑及復性劑的篩選，最終選用8mol/L 尿素作為變性劑將重組蛋白溶解并充分變性，選用含有甘油、聚乙二醇、氯化鈉和β-巰基乙醇的復性劑進行稀釋復性，形成具有生物活性的人參皂苷葡萄糖苷酶蛋白。這進一步證明了以前提取的人參皂苷葡萄糖苷酶基因的正確性，也為研究在原核微生物中表達真核基因提供了科學依據(jù)。