張艷敏，李 成，武 瑤，梁雯靖，宋宛霖，姚 鵬，叢麗娜，劉志文

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

對(duì)蝦溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，可以與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用形成復(fù)合物，抵御侵入機(jī)體的病毒和細(xì)菌，是對(duì)蝦機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中的重要防御因子[1]。與其他利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白一樣，重組對(duì)蝦溶菌酶在表達(dá)過程中也會(huì)形成不溶的、無生物活性的包涵體。目前，重組對(duì)蝦溶菌酶包涵體的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性等[2]。然而，關(guān)于重組蛋白復(fù)性后高回收率、高活性和高純度的報(bào)道不多，特別是層析法復(fù)性包涵體蛋白的研究較少。親和層析法復(fù)性包涵體蛋白不但可以實(shí)行純化和復(fù)性同時(shí)進(jìn)行，同時(shí)固相介質(zhì)作為分子伴侶可以減少蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚合，并且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性對(duì)重組對(duì)蝦溶菌酶包涵體進(jìn)行處理，并對(duì)2種方法復(fù)性的重組蛋白進(jìn)行比較，以期為進(jìn)一步深入研究對(duì)蝦溶菌酶包涵體復(fù)性提供有益的借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌 種

重組中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)溶菌酶基因工程菌pET30a(＋)－FcLys／Rosetta(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.2 方 法

1.2.1 裂解菌體

挑取pET30a(＋)－FcLys／Rosetta(DE3)菌株，過夜活化后，按1%的接種量接種于含100μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160r／min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.7(約3h)，加入0.5mmol／L IPTG，低溫(28℃)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。離心收集菌體并于－20℃凍管保存。

用含有1%Triton X－100的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸凍融后的菌體，將其置于冰浴中超聲破碎(功率300W；破碎／間隔1s／3s)5min左右。低溫高速離心，使大多數(shù)包涵體沉淀與可溶性蛋白分離，收集沉淀，棄上清液。

1.2.2 洗滌包涵體

由于脂體及破碎的部分細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體沉淀粘連在一起，在溶解包涵體沉淀之前，一定要洗滌包涵體。在洗滌緩沖液(50mmol／L Tris－HCl，0.5mol／L NaCl，2%Triton X－100，2mmol／L EDTA，2mol／L 尿素，pH 8.0)中，超聲洗滌包涵體沉淀(超聲功率300W，破碎／間隔1s／3s)約 5min。低溫高速離心(4 ℃，12 000r／min)，棄上清，取沉淀。重復(fù)此步驟，將沉淀在洗滌緩沖液中再洗滌一次。

1.2.3 溶解包涵體

將洗滌后的包涵體加入到20mL溶解緩沖液 中 (50mmol／L Tris－HCl，8mol／L 尿 素，0.5mol／L NaCl，2mmol／Lβ－巰基乙醇)，于搖床上25℃、100r／min震動(dòng)溶解4h，然后經(jīng)4℃、12 000r／min離心10min，取上清，即得FcLys包涵體溶解液。

1.2.4 包涵體的稀釋復(fù)性

取一定量的包涵體溶解液，加入不含尿素的包涵體復(fù)性緩沖液 (50mmol／L Tris－HCl，0.5mol／L NaCl，2mmol／L β－巰基乙醇，1mmol／L谷胱甘肽，0.2mmol／L氧化性谷胱甘肽，1mmol／L CaCl2)，將體系中尿素的濃度稀釋到4mol／L，將該反應(yīng)置于4℃靜止8h。再加入復(fù)性緩沖液將體系的尿素濃度降至3mol／L，并于4℃靜止8h。最后再加入復(fù)性緩沖液將尿素濃度降至2mol／L，同樣置于4℃靜止8h。將該復(fù)性液放入透析袋中依次在不含尿素的復(fù)性緩沖液中和PBS中透析處理。

1.2.5 包涵體的親和層析復(fù)性

將5倍柱體積的結(jié)合緩沖液(20mmol／L Na3PO4，0.5mol／L NaCl，20mmol／L 咪唑，pH 8.0)以1mL／min的體積流量通過1mL的Ni2＋親和層析柱來平衡柱子。將包涵體溶解液經(jīng)0.45μm濾膜過濾除去大分子雜質(zhì)，以體積流量0.5mL／min經(jīng)過被結(jié)合緩沖液結(jié)合過的柱子。再分別用含4、3、2mol／L尿素的復(fù)性緩沖液依次通過Ni2＋柱，以體積流量0.5mL／min各流經(jīng)柱子4h，使重組蛋白在Ni2＋柱上復(fù)性。用洗脫緩沖液(500mmol／L 咪唑，50mmol／L Tris－Hcl，300mmol／L NaCl)以體積流量1mL／min將目的蛋白從親和層析柱上洗脫下來。將收集到樣品在PBS中透析處理。

1.2.6 親和層析復(fù)性的條件優(yōu)化

1.2.6.1 蛋白上樣量對(duì)復(fù)性的影響

分別取0.1、0.2、0.4、0.6mL包涵體變性溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min，復(fù)性后用0.5mol／L咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液在PBS緩沖液中透析，Bradford法測(cè)蛋白濃度。

1.2.6.2 復(fù)性液pH對(duì)復(fù)性的影響

取200μL變性蛋白溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min。復(fù)性液pH選為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。復(fù)性后按照“1.2.6.1”方法進(jìn)行洗脫、透析、測(cè)蛋白濃度。

1.2.6.3 溫度對(duì)復(fù)性的影響

取200μL變性蛋白溶液上樣，復(fù)性緩沖液體積流量為0.5mL／min，復(fù)性溫度選在10、25℃。復(fù)性后按“1.2.6.1”方法進(jìn)行洗脫、透析、測(cè)蛋白濃度。

1.2.7 分析方法

蛋白濃度根據(jù)Bradford法進(jìn)行測(cè)定[4]。通過Bandscan 5.0軟件分析蛋白純度。

1.2.8 復(fù)性蛋白的生物活性檢測(cè)

取本實(shí)驗(yàn)室保存的革蘭陽性菌溶壁微球菌(M.lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭陰性菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為指示菌，用透析液PBS作為對(duì)照，采用瓊脂平板擴(kuò)散法[5]檢測(cè)復(fù)性重組蛋白FcLys的抑菌活性。在制備好的瓊脂平板上放置牛津杯，牛津杯中加入0.2mL透析后的重組蛋白FcLys，將平板放在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 包涵體的收集和洗滌

發(fā)酵完成后，菌體經(jīng)離心、沉淀被超聲破碎，再次離心，經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測(cè)，上清液中無明顯的重組FcLys蛋白(圖1Line 3)，重組FcLys蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中(圖1Line 4)。本實(shí)驗(yàn)采用 Triton X－100、EDTA 和尿素聯(lián)合洗滌法，經(jīng)2次洗滌，有效地去除了包涵體中的雜質(zhì)，如脂類、脂多糖、核酸、雜蛋白等，提高了目的蛋白純度，有利于之后的復(fù)性過程。同時(shí)，隨著洗滌次數(shù)的增加，目的蛋白的損失量也越來越多，因此要根據(jù)實(shí)際情況確定適宜的洗滌次數(shù)。

圖1 重組FcLys蛋白的表達(dá)及洗滌Fig.1 Expression and washing of recombinant FcLys

2.2 復(fù)性方法比較

通過稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性對(duì)包涵體進(jìn)行處理，得到復(fù)性成功的重組蛋白FcLys，電泳檢測(cè)如圖2(Line 2，Line 3)。根據(jù)Bradford法來測(cè)定蛋白濃度從而得出蛋白回收率，通過Bandscan軟件來分析蛋白純度。由表1可知，親和層析復(fù)性得到的FcLys蛋白在蛋白純度和蛋白回收率方面明顯優(yōu)于稀釋復(fù)性。

圖2 復(fù)性后重組FcLys蛋白SDS－PAGE檢測(cè)Fig.2 Identification of recombinant FcLys by SDS－PAGE

表1 FcLys蛋白2種復(fù)性方法的比較Tab.1 Comparison of two methods of FcLys protein refolding

2.3 復(fù)性包涵體蛋白的生物活性檢測(cè)

通過表2可知，經(jīng)稀釋復(fù)性和親和層析復(fù)性得到的重組蛋白FcLys對(duì)革蘭陽性菌溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，對(duì)革蘭陰性菌則無抑菌效果。而作為對(duì)照的透析液PBS對(duì)所有指示菌均沒有抑菌效果。親和層析復(fù)性得到的重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的活性要比稀釋復(fù)性得到的重組蛋白的活性高26.3%，并且對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，前者比后者高25%。

表2 重組FcLys蛋白抑菌活性檢測(cè)Tab.2 Antimicrobial activities of the recombinant FcLys

2.4 親和層析復(fù)性影響蛋白回收率的因素

2.4.1 蛋白上樣量對(duì)復(fù)性的影響

當(dāng)上樣量為0.1、0.2、0.4、0.6mL時(shí)，蛋白的回收效率分別為36.2%、22%、16%和12%。由此可見，隨著上樣量的增加，復(fù)性蛋白回收率降低。因在親和層析柱上的蛋白，在復(fù)性過程中會(huì)形成聚集體，隨著蛋白濃度增加，聚集機(jī)會(huì)增大，導(dǎo)致復(fù)性效率會(huì)降低。蛋白上樣量越低，越有利于復(fù)性，但濃度過低，不利于蛋白的回收，并影響產(chǎn)量，應(yīng)用中要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的上樣量。

2.4.2 復(fù)性液pH對(duì)復(fù)性的影響

如圖3，包涵體復(fù)性的最適pH為8.0左右。偏中性條件下，重組蛋白中半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基較穩(wěn)定，不利于二硫鍵形成。實(shí)驗(yàn)表明，弱堿環(huán)境有利于包涵體復(fù)性，但過高的pH又會(huì)加快二硫鍵的形成，導(dǎo)致錯(cuò)配，形成沉淀，降低回收效率。

圖3 pH對(duì)蛋白回收率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of the recombinant FcLys refolding

2.4.3 溫度對(duì)復(fù)性的影響

在10℃復(fù)性時(shí)，蛋白回收率為24.5%，在25℃復(fù)性時(shí)，蛋白回收率為33.6%。說明溫度越高，復(fù)性效率就越好。因?yàn)榈鞍缀凸滔嘟橘|(zhì)結(jié)合，即使溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)也受到限制，不會(huì)像稀釋復(fù)性那樣易形成聚集體，提高溫度，加快了復(fù)性速度，從而提高復(fù)性效率。但溫度不能超過酶的最適溫度，否則酶會(huì)發(fā)生不可逆變性，從而失去活性。

3 結(jié) 論

中國明對(duì)蝦溶菌酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)含有8mol／L尿素的溶解緩沖液處理后，F(xiàn)cLys包涵體變性溶解。通過比較稀釋復(fù)性法和親和層析復(fù)性法對(duì)包涵體復(fù)性產(chǎn)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親和層析復(fù)性明顯優(yōu)于稀釋復(fù)性，具有更高的蛋白復(fù)性產(chǎn)率，并且得到的可溶性蛋白回收率也要高于許多相關(guān)蝦類文獻(xiàn)報(bào)道(表3)。在親和層析復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，通過優(yōu)化了上樣量、pH和溫度3種因素發(fā)現(xiàn)，較低濃度的蛋白復(fù)性液在pH 8.0的緩沖體系下，降低上樣量并提高環(huán)境溫度，會(huì)有效提高復(fù)性效率。親和層析復(fù)性得到高純度、可溶的重組對(duì)蝦溶菌酶蛋白對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌均具有高效的抑菌活性。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究對(duì)蝦溶菌酶的性質(zhì)和功能奠定了基礎(chǔ)。

表3 相關(guān)對(duì)蝦溶菌酶包涵體研究的比較Tab.3 Comparison of inclusion body of shrimp lysozymes

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