，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032)

生殖器皰疹(GH)是一種常見(jiàn)的性傳播疾病，主要通過(guò)水平性接觸傳播，也能垂直感染胎兒及新生兒，導(dǎo)致流產(chǎn)及新生兒死亡.GH主要由單純皰疹病毒II型(HSV-2)感染所致[1].近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查表明：HSV-2感染與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[2-3]，還會(huì)增加人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的風(fēng)險(xiǎn)[4-5].Looker KJ等根據(jù)全球12個(gè)地區(qū)的匯總數(shù)據(jù)估計(jì)，2003年全球15～49歲人群中，HSV-2感染的患病率約為16.2%，發(fā)病率約為0.7%，僅2003年全球新增HSV-2感染者約2 360萬(wàn)人[6].因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速和低成本的HSV-2初篩方法，對(duì)GH的輔助診斷和控制傳播具有重要的意義.本研究為了探索前期篩選到的高特異性抗HSV-2糖蛋白B的單鏈抗體在GH診斷中的應(yīng)用價(jià)值，構(gòu)建了抗HSV-2單鏈抗體和堿性磷酸酶的融合表達(dá)載體，并進(jìn)行了包涵體的復(fù)性研究.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pLac-duet-1-AKP和pCANTAB5E-H3由杭州遠(yuǎn)方生物科技有限公司提供.

1.1.2 酶及主要試劑

限制性內(nèi)切酶NotI、NcoI和T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，DNA和蛋白購(gòu)自Fermentas公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司，Ni2+-NTA基質(zhì)購(gòu)自QIAGEN公司.

1.2 方 法

1.2.1 融合表達(dá)載體pLac-H3-AKP的構(gòu)建

質(zhì)粒pLac-duet-1-AKP是將pETduet-1(Novagen公司)質(zhì)粒中T7啟動(dòng)子用大腸桿菌Lac啟動(dòng)子替代，并插入了一個(gè)進(jìn)化后酶活性提高30倍左右的大腸桿菌堿性磷酸酶基因片段；pCANTAB5E-H3是從本室早先構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中篩選到的針對(duì)單純皰疹病毒糖蛋白B抗原的N端特異性中和抗體，這個(gè)抗體識(shí)別抗原的立體結(jié)構(gòu)，能有效封閉病毒與相應(yīng)細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)從而阻斷病毒侵入細(xì)胞.分別用限制性內(nèi)切酶NotI和NcoI雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳目標(biāo)條帶用凝膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒用NotI和NcoI雙酶切鑒定克隆是否含有目標(biāo)載體，含預(yù)期大小基因片段的克隆送上海生工測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pLac-H3-AKP.

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)及包涵體的制備

將表達(dá)載體pLac-H3-AKP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，再次抽提質(zhì)粒雙酶切確認(rèn)是否含有目標(biāo)載體.將確認(rèn)后的克隆接種至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1：100比例接種于1 L新鮮的含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)37 ℃搖床振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h.4 ℃，4 000 r/m收集菌體15 min，每克濕菌體用10 mL PBS洗滌兩次，再以相同比例的含有0.5 mol/L NaCl的預(yù)冷PBS重懸細(xì)菌，反復(fù)凍融三次后，放冰水浴中超聲至菌體完全裂解，12 000 r/m離心15 min，收集包涵體沉淀.

設(shè)置無(wú)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照組，并設(shè)計(jì)了各組未誘導(dǎo)全菌、誘導(dǎo)全菌、破菌后上清和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳以確定表達(dá)產(chǎn)物的定位.

1.2.3 包涵體的純化

每克包涵體用5 mL洗滌緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L尿素，1% Triton X-100，pH 8.0)洗滌包涵體3次.洗滌后的包涵體復(fù)性前采用兩步變性法處理：每300 mg包涵體用1 mL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L鹽酸胍，pH 8.0)重懸后室溫?fù)u床振蕩過(guò)夜以溶解包涵體，次日12 000 r/m離心15 min，棄去沉淀，上清用40倍體積超純水迅速稀釋，使蛋白重新聚集沉淀過(guò)夜，12 000 r/m離心30 min，保留沉淀，用變性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)重新溶解沉淀，12 000 r/m離心15 min，上清過(guò)0.45 μm濾膜備用.

按制造商推薦的方法用10倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡鎳離子螯合介質(zhì).將尿素變性溶解的包涵體溶液與平衡好的螯合介質(zhì)混勻，室溫溫和混勻30 min使之充分結(jié)合，用10倍柱體積的洗滌緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，40 mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗滌鎳離子螯合介質(zhì).從低到高以不同濃度梯度的咪唑洗脫緩沖液競(jìng)爭(zhēng)性洗脫目的蛋白，每個(gè)濃度2個(gè)柱體積洗脫.12% SDS-PAGE電泳分析目的蛋白有效洗脫濃度和純度.洗脫液中加入終濃度為10 mmol/L DTT打開(kāi)二硫鍵.用含有50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素的pH為8.0的緩沖液低溫透析除去咪唑和DTT，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度.

1.2.4 包涵體的復(fù)性

復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，0.5 mol/L尿素，0.5 mol/L精氨酸，1 mmol/L GSSG和1 mmol/L GSH，pH 8.0)，蛋白的初始復(fù)性質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，放4 ℃冰箱中復(fù)性24 h.

1) 不同pH值對(duì)復(fù)性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預(yù)冷的不同pH值的復(fù)性緩沖液中，pH值分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，蛋白的初始復(fù)性質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中復(fù)性24 h，12 000 r/m離心15 min，測(cè)定上清中AKP比活.

2) 不同初始復(fù)性蛋白質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預(yù)冷的復(fù)性緩沖液中，初始的復(fù)性蛋白質(zhì)量濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 mg/mL.放4 ℃冰箱中復(fù)性24 h，12 000 r/m離心15 min，測(cè)定上清中AKP比活.

3) 不同濃度比例的GSSG和GSH對(duì)復(fù)性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預(yù)冷的不同濃度比例的復(fù)性緩沖液中，GSSG終濃度為1 mmol/L，GSH終濃度分別為0.5，1，2，3，4 mmol/L，蛋白的初始復(fù)性質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中復(fù)性24 h，12 000 r/m離心15 min，測(cè)定上清中AKP比活.

4) 不同時(shí)間對(duì)復(fù)性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預(yù)冷的復(fù)性緩沖液中，蛋白的初始復(fù)性質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中分別復(fù)性12，24，36，48，60 h，12 000 r/m離心15 min，測(cè)定上清中AKP比活.

1.2.5 復(fù)性后融合蛋白的分析鑒定

進(jìn)行8% SDS-PAGE和抗原結(jié)合活性鑒定：用包被緩沖液稀釋HSV-2糖蛋白B抗原至1 μg/mL，取100 μL加入96孔板4 ℃包被過(guò)夜，空白對(duì)照孔加等量包被液.次日移去包被液，用含0.05% Tween-20的PBS洗3次，1% BSA 37 ℃封閉1 h，移去封閉液，用含0.05% Tween-20的PBS洗3次，加入100 μL復(fù)性后的融合蛋白(1 μg/mL)37 ℃反應(yīng)1 h，PBS洗3次，然后分別加入50 μL堿性磷酸酶試劑盒中溶液I和溶液II，37 ℃顯色15 min，再加入50 μL堿性磷酸酶試劑盒中溶液III，與空白對(duì)照對(duì)比觀察顏色變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 融合表達(dá)載體pLac-H3-AKP的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切消化后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一條大小約5 200 bp的條帶和一條大小約750 bp的條帶，理論上重組質(zhì)粒應(yīng)該由一個(gè)大小約5 200 bp的載體片段和一個(gè)大小約750 bp的單鏈抗體基因片段組成，可見(jiàn)電泳顯示的兩個(gè)條帶大小均與理論值相符(圖1)，表明成功地構(gòu)建了融合表達(dá)載體pLac-H3-AKP.該載體含Lac啟動(dòng)子，可用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)在堿性磷酸酶的羧基端設(shè)計(jì)有編碼6個(gè)組氨酸的密碼子序列使表達(dá)的融合蛋白含有6個(gè)組氨酸，便于金屬螯合層析純化.

M-1 kb DNA Ladder; 1-重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 融合蛋白的表達(dá)及包涵體的制備

對(duì)比未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白，可見(jiàn)誘導(dǎo)后的全菌蛋白及破菌沉淀在SDS-PAGE電泳中均出現(xiàn)約75 kD大小的條帶(圖2)，而經(jīng)誘導(dǎo)后的破菌上清中未見(jiàn)明顯差異條帶，表明融合蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)且主要以包涵體形式存在.

M-Protein Marker；1-未誘導(dǎo)全菌；2-誘導(dǎo)全菌；3-誘導(dǎo)后破菌上清；4-誘導(dǎo)后破菌沉淀

2.3 包涵體的純化

12% SDS-PAGE電泳顯示，純化后的包涵體蛋白能被適當(dāng)濃度的咪唑有效洗脫，在200 mmol/L咪唑洗脫時(shí)純度達(dá)到75%左右(圖3).

1-未純化包涵體；2-100 mmol/L咪唑洗脫；3-150 mmol/L咪唑洗脫；4-200 mmol/L咪唑洗脫；5-250 mmol/L咪唑洗脫

2.4 包涵體的復(fù)性

1) 不同pH值對(duì)復(fù)性效果的影響

通常來(lái)說(shuō)，復(fù)性緩沖液的pH值需要大于7.0，用來(lái)防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響二硫鍵的正確配對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)復(fù)性緩沖液pH值為7.5左右時(shí)(圖4)，離心上清中的復(fù)性蛋白比活最高.

圖4 不同pH值對(duì)復(fù)性效果的影響曲線

2) 不同初始復(fù)性蛋白質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)性效果的影響

采用稀釋法復(fù)性，需要確定最佳初始蛋白質(zhì)量濃度，蛋白質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)增加分子間相互碰撞的幾率，使蛋白更容易發(fā)生聚集.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)初始復(fù)性蛋白質(zhì)量濃度為0.1～0.15 mg/mL左右時(shí)(圖5)，離心上清中的復(fù)性蛋白比活最高.

圖5 不同初始復(fù)性蛋白質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)性效果的影響曲線

3) 不同濃度比例的GSSG和GSH對(duì)復(fù)性效果的影響

包涵體變性時(shí)，蛋白中的二硫鍵被DTT完全打開(kāi)，復(fù)性時(shí)，需要一定的氧化劑將其重新氧化，同時(shí)還需要一定的還原劑對(duì)錯(cuò)配的和不穩(wěn)定的二硫鍵重新還原，這兩個(gè)過(guò)程的有機(jī)結(jié)合才能得到較好的復(fù)性效果.本實(shí)驗(yàn)采用適當(dāng)比例的GSSG和GSH來(lái)提供所需的氧化還原環(huán)境，最終確定復(fù)性液中GSSG濃度為1 mmol/L，GSH濃度為3 mmol/L最為合適(圖6)，離心上清中的復(fù)性蛋白比活最高.

圖6 不同濃度比例的GSSG和GSH對(duì)復(fù)性效果的影響曲線

4) 不同時(shí)間對(duì)復(fù)性效果的影響

蛋白復(fù)性是一個(gè)緩慢的過(guò)程，需要充足的時(shí)間做保證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：融合蛋白在復(fù)性24 h后，復(fù)性率趨于不變(圖7).

圖7 不同時(shí)間對(duì)復(fù)性效果的影響曲線

5) 復(fù)性后融合蛋白的分析鑒定

確定最佳復(fù)性條件為復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，0.5 mol/L尿素，0.5 mol/L精氨酸，1 mmol/L GSSG和3 mmol/L GSH，pH 7.5)，蛋白的初始復(fù)性質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL，4 ℃復(fù)性24 h.

8% SDS-PAGE電泳顯示復(fù)性后融合蛋白約為75 kD大小(圖8).

M-Protein Marker；1-復(fù)性后融合蛋白

為了驗(yàn)證復(fù)性后的融合蛋白是否具有HSV-2抗原結(jié)合活性，本實(shí)驗(yàn)用直接ELISA法鑒定復(fù)性液檢測(cè)抗原的活性.結(jié)果表明：復(fù)性后的融合蛋白不僅能識(shí)別特異性抗原還能有效顯示酶活性，證明了該融合蛋白具有融合前兩個(gè)分子的雙重功能.ELISA結(jié)果見(jiàn)圖9.

1-空白對(duì)照；2，3，4-三組平行ELISA

3 結(jié) 論

單鏈抗體分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于與各種分子融合形成多重功能的融合蛋白.堿性磷酸酶是廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)中的一種標(biāo)記酶.常規(guī)的酶標(biāo)二抗采用化學(xué)交聯(lián)方法制備，存在步驟繁瑣、標(biāo)記率低、成本高的弊端.使用基因工程技術(shù)將識(shí)別單元和顯示單元融合表達(dá)制備出具有雙重功能活性的融合蛋白，這不僅省略了酶標(biāo)抗體的制備過(guò)程，而且還可以使檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)單快速[7-8].我們構(gòu)建了含有抗HSV-2單鏈抗體基因和堿性磷酸酶基因的融合表達(dá)載體并在大腸桿菌中獲得了包涵體形式為主的融合蛋白表達(dá)，包涵體經(jīng)過(guò)兩步變性法[9]變性，再用鎳離子金屬螯合層析純化，最后初步探索了影響這種融合蛋白復(fù)性的因素，為今后產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)診斷試劑打下了一定的基礎(chǔ).實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：大腸桿菌可以有效地表達(dá)單鏈抗體和堿性磷酸酶融合蛋白，這種融合蛋白經(jīng)過(guò)復(fù)性可以恢復(fù)原有兩個(gè)蛋白的各自生物學(xué)活性.堿性磷酸酶還可以作為復(fù)性的指示劑，通過(guò)檢測(cè)它的活性可以評(píng)估其融合伴侶是否也得以復(fù)性.該雙重功能活性的融合蛋白可應(yīng)用于快速免疫篩查，使ELISA不再需要酶標(biāo)二抗，簡(jiǎn)化了ELISA步驟、縮短了檢測(cè)的時(shí)間、省下了常規(guī)化學(xué)交聯(lián)制備酶標(biāo)二抗的成本，具有一定的應(yīng)用前景.

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