唐曉倩，耿玉清，陳艷鑫，郜少敏，楊雨果

(北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083)

土壤磷酸酶可水解有機(jī)磷的磷酸酯或磷酸酐，在土壤有機(jī)磷礦化過程中發(fā)揮重要作用。提高磷酸酶活性是提高土壤磷有效性的一種生物途徑[1]。因此，及時(shí)準(zhǔn)確地測定和了解土壤磷酸酶活性的高低，對土壤磷素的管理具有重要意義。由于分離技術(shù)的限制，目前直接從土壤中提取酶尚有一定的難度。因此，對土壤磷酸酶活性的測定，主要是在土壤中添加一定數(shù)量對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)，在一定pH值的緩沖液和溫度等環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最終通過測定酶促反應(yīng)后生成物的量來計(jì)算酶的活性[2]。

酶促反應(yīng)是在一定環(huán)境條件下進(jìn)行的。其中pH值與酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及酶對底物的親和力密切相關(guān)[3]，對土壤酶活性的測定結(jié)果有顯著影響[4]。由于pH值對酶活性的顯著作用，為減少培養(yǎng)過程中因pH值浮動(dòng)而造成的影響，通常采用一定的緩沖液來實(shí)現(xiàn)較穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，而不同緩沖液影響下酶活性高低也有所不同。不適宜的pH值可能給酶促反應(yīng)生成物的測定造成困難[5]。

由于pH值對磷酸酶活性的影響非常顯著，通常根據(jù)pH值將土壤磷酸酶分為酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)和堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[5]。目前國內(nèi)外學(xué)者測定酸性磷酸酶活性的方法不一。就酶促反應(yīng)的環(huán)境條件而言，國外學(xué)者主要采用pH值為5的醋酸鹽緩沖液[6-8]，也有學(xué)者認(rèn)為pH值為6.5的MUB緩沖液是測定土壤酸性磷酸酶活性最適宜的培養(yǎng)條件[2,9-10]。此外，有學(xué)者建議依據(jù)土壤本身pH值的大小，選擇合適種類的緩沖液，測定土壤酸性磷酸酶活性[11-12]。因此，雖然土壤酸性磷酸酶的測定是比較簡單的過程，但不同研究者所選擇的培養(yǎng)條件是多元化的。如何針對具體的土壤選擇適宜的pH值及緩沖液種類，還缺乏系統(tǒng)的研究。這在一定程度上給土壤磷酸酶的測定方法造成了選擇上的困難。因此，本研究選用不同pH值的土壤，研究不同緩沖液及pH值對土壤酸性磷酸酶活性的影響，為選擇適宜的測定酸性磷酸酶活性的培養(yǎng)條件提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究選擇6種土壤。土壤pH值用梅特勒—托利多酸度計(jì)(FE20K)測定。土壤有機(jī)碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法測定。土壤全氮測定采用凱氏消煮法，定氮儀蒸餾。堿解擴(kuò)散法測土壤堿解氮。土壤有效磷采用碳酸氫鈉法測定。土壤速效鉀采用乙酸銨提取，用火焰光度計(jì)測定[13]。土壤采樣地點(diǎn)和常規(guī)指標(biāo)分析結(jié)果見表1。

表1 土樣的基本情況

1.2 測定方法

1.2.1 pH值與緩沖液的選擇

根據(jù)我國大部分土壤pH值為4～9的范圍，以及有學(xué)者將最適pH值5～6的磷酸酶定義為酸性磷酸酶，本研究采用的pH值分別為4、5和6，共3個(gè)梯度。緩沖液的選擇主要基于目前酶測定過程中廣泛應(yīng)用的3種類型，分別為50 mmol/L醋酸鹽緩沖液(簡稱ACEB)[7-8]、50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(簡稱CITB)[14]以及改進(jìn)的通用緩沖液(簡稱MUB)[2,15]。根據(jù)pH值和緩沖液種類的選擇，本研究共采用9種緩沖液培養(yǎng)條件。為盡量減少在調(diào)節(jié)pH值過程中引入外來離子對酶促反應(yīng)的干擾，本研究選用0.5 mol/L醋酸和0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)ACEB的pH值；用50 mmol/L檸檬酸和50 mmol/L檸檬酸鈉調(diào)節(jié)CITB的pH值；用0.1 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)MUB的pH值。

1.2.2 終止劑的選擇

在常規(guī)的土壤磷酸酶活性測定過程中，酶促反應(yīng)結(jié)束后通常通過添加0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L NaOH來終止反應(yīng)，并使其顯色[16]。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在所選用高有機(jī)質(zhì)含量土樣中，添加0.5 mol/L NaOH后可因腐殖質(zhì)的水解干擾而影響比色結(jié)果。因此，本研究改用0.1 mol/L，pH值為12的Tris終止反應(yīng)[2]。

1.2.3 測定過程

測定方法參照文獻(xiàn)[2]中介紹的方法，以對硝基苯磷酸二鈉(C6H4NNa2O6P·6H2O，CAS編號：4264-83-9)為底物。測定方法略作修改，具體為：稱取1.00 g新鮮土壤，添加8 mL緩沖液和1 mL對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)溶液后，輕搖混勻，于37℃下培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在混合土液中添加1 mL 0.5 mol/L的CaCl2和4 mL 0.1 mol/L的Tris緩沖液(pH值12)終止反應(yīng)。經(jīng)過濾后，在410 nm波長條件下進(jìn)行比色測定。在測定土壤酶活性的同時(shí)做空白參照?？瞻讌⒄諏?shí)驗(yàn)與土壤磷酸酶活性測定的區(qū)別是，在培養(yǎng)結(jié)束后添加對硝基苯磷酸二鈉。用每小時(shí)1 g土酶促反應(yīng)產(chǎn)物(對硝基酚)的μmol量表示土壤酸性磷酸酶活性，酶活性單位為μmolpNP/(g·h)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2007軟件進(jìn)行整理，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示土壤酸性磷酸酶活性。不同土壤酸性磷酸酶活性差異采用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩差異顯著性比較采用Duncan法(P<0.05)。pH值和緩沖液種類與酶活性的交互作用采用Two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05)。基于多因素方差分析進(jìn)行pH值、緩沖液種類和不同土樣對酶活性影響的研究(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下土壤酸性磷酸酶活性的區(qū)分度

在不同的緩沖液和不同pH值培養(yǎng)條件下，測得的6個(gè)土樣之間酸性磷酸酶活性的區(qū)分度有一定的區(qū)別(表2)。就土樣磷酸酶活性的數(shù)值來看，在pH值4和5的培養(yǎng)條件下，樣1、2、3和4的酸性磷酸酶活性均在CITB條件下最高；在pH值6時(shí)，6個(gè)土樣酸性磷酸酶活性均在ACEB培養(yǎng)條件下最高。從不同土樣之間土壤酸性磷酸酶活性的區(qū)分度來看，不同的培養(yǎng)條件也存在一定的差異。其中，在pH值4和5條件下，不同土樣間土壤酸性磷酸酶活性的區(qū)分度均在CITB條件中顯著，6個(gè)土樣間酶活性的差異區(qū)分序列為a、b、c、cd、cd、d和a、b、c、d、e、f；而在pH值6條件下，土樣間酸性磷酸酶活性的區(qū)分度在ACEB條件中最顯著，區(qū)分序列為a、b、c、d、e、f。就MUB而言，無論pH值為4、5還是6，不同土樣之間酸性磷酸酶活性變化的區(qū)分序列均為a、b、c、d，較其他2種緩沖液的差異的變化相對平緩。

表2 不同培養(yǎng)條件下土壤酸性磷酸酶活性 [μmol pNP/(g·h)]

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同pH值條件下土壤酸性磷酸酶活性的變化

針對同一緩沖液環(huán)境條件下，隨著pH值的變化，土樣酸性磷酸酶活性變化幅度與方向不同(表3)。從表3可以看出，由pH值4到5時(shí)，樣1、2和3在3種不同緩沖液條件下所測土壤的酸性磷酸酶活性變化量均為正值，變化幅度均在ACEB條件下最大，在MUB條件下最?。欢鴺?、5和6在3種不同緩沖液條件下變化不盡一致。其中，樣4和6的酸性磷酸酶活性變化量在MUB條件下表現(xiàn)為負(fù)值，且變化幅度在該條件下最小。

在pH值由5到6時(shí)，樣1、2和3土壤酸性磷酸酶活性變化量均在ACEB和MUB條件下為正值，在CITB條件下為負(fù)值。樣4、5和6在不同環(huán)境條件下變化量不同，其中，樣4在MUB條件下酸性磷酸酶活性變化量表現(xiàn)為正值，而樣5和6在ACEB條件下表現(xiàn)為正值。就變化幅度而言，這6種土樣在ACEB和CITB條件下的酸性磷酸酶活性變化幅度，均高于MUB緩沖液條件下的變化幅度。

就同一土樣而言，在緩沖液由pH值4變化到6時(shí)，土壤酸性磷酸酶活性的極差不同(表3)。除樣4外，不同土樣酸性磷酸酶活性的極差值均在ACEB條件下為最大，變化范圍為6.01～31.88；而在MUB條件下極差值最小，變化范圍為1.79～5.95，酶活性變化范圍窄。因此，在同樣pH值的變化區(qū)間內(nèi)，不同土樣酸性磷酸酶活性的變化幅度有較大的差異。

表3 不同pH值條件下土壤酸性磷酸酶活性變化 [μmol pNP/(g·h)]

注：△1：表示pH值4～5一個(gè)單位酶活性變化；△2：表示pH值5～6一個(gè)單位酶活性變化；R：表示pH值4～6酶活性極差。

2.3 不同緩沖條件下土壤酸性磷酸酶活性變異的統(tǒng)計(jì)

不同緩沖液條件下，所測土壤酸性磷酸酶活性的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4。在ACEB培養(yǎng)條件下，土壤酸性磷酸酶活性的極差隨著pH值的增加而增大，pH值6時(shí)極差達(dá)到最大值(33.40)。就變異系數(shù)而言，在緩沖液pH值為4時(shí)的酸性磷酸酶活性變異系數(shù)為1.08，高于pH值5和6時(shí)的變異系數(shù)。

在CITB緩沖條件下，不同pH值之間土壤酸性磷酸酶活性的平均值、極差和變異系數(shù)的變化幅度明顯。其中，土壤酸性磷酸酶活性的平均值和極差在pH值5的緩沖條件下達(dá)到最大值，而變異系數(shù)最小，僅為0.51。

相對于ACEB和CITB緩沖液，用MUB緩沖液條件測定的6個(gè)不同土樣的酸性磷酸酶活性的平均值、極差數(shù)值和變異系數(shù)比較接近。其中，當(dāng)緩沖液pH值從4變化到6時(shí)，土壤酸性磷酸酶活性極差數(shù)值變化范圍是23.39～27.82；變異系數(shù)數(shù)值變化范圍是0.80～0.92。由此看來，用MUB緩沖液測定的不同土樣之間的變異系數(shù)較其他緩沖液大，且與緩沖液pH值的變化無關(guān)。

表4 土壤酸性磷酸酶活性統(tǒng)計(jì)分析

2.4 pH值和緩沖液對土樣磷酸酶活性的共同影響

pH值和緩沖液種類是同時(shí)作用于土壤磷酸酶的培養(yǎng)條件，二者共同影響著土壤磷酸酶活性測定。通過雙因素方差分析表明，緩沖液的pH值高低、種類以及二者的交互作用均顯著影響土壤酸性磷酸酶活性的變化(表5)，但對不同土樣影響的程度有所不同。樣1、2、3和4中，pH值對土壤酸性磷酸酶活性變化的影響程度大于緩沖液種類以及二者交互的影響程度；而在樣5和6中，pH值的影響程度相對較小。這說明pH值和緩沖液種類對土壤酸性磷酸酶活性的影響程度，與選定的土樣有關(guān)。

表5 pH值與緩沖液對土壤酶活性影響的雙因素方差分析

3 討論

3.1 土壤特征對土壤酸性磷酸酶活性的影響

土壤酶來源于生物的分泌，其活性受多種土壤性質(zhì)的影響。本研究選取了6種不同土壤類型的土樣，利用3種廣泛使用的緩沖液，比較不同pH值條件下土壤酸性磷酸酶活性，力求找出具有普遍性的適宜緩沖液和pH值。但利用三因素方差分析發(fā)現(xiàn)，不同土樣(F=1 675.28，p=0.00)對土壤酸性磷酸酶活性的影響最顯著(表6)，其次是pH值(F=708.94，p=0.00)對酶活性的影響，而緩沖液種類對酶活性的影響程度最小(F=125.58，p=0.00)(表6)。因此，在不同緩沖液測定的土壤酸性磷酸酶差異中，土樣起關(guān)鍵作用。

表6 緩沖液pH值和種類與土壤類型對土壤酶活性影響的三因素分析

雖然影響土壤酸性磷酸酶活性高低的性質(zhì)指標(biāo)很多，但對土壤就pH值和有機(jī)質(zhì)指標(biāo)的研究非常普遍。就所選定的土樣而言，土壤pH值低，土壤有機(jī)質(zhì)含量高的土樣如樣1和2，土壤酸性磷酸酶活性相對較高，而樣6的pH值高，土壤有機(jī)質(zhì)低，土壤酸性磷酸酶活性相對較低。對土壤pH值、有機(jī)碳和土壤酸性磷酸酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，土壤pH值、有機(jī)碳和酸性磷酸酶活性相關(guān)程度弱。由于土壤酸性磷酸酶活性受多因素的影響，而選定的不同土壤類型因存在多變量的差異，使得緩沖液及pH值對土壤酸性磷酸酶的影響甚為復(fù)雜。針對土壤自身pH值可顯著影響土壤酸性磷酸酶活性的狀況，在土壤酸性磷酸酶的測定中，對適宜緩沖液和pH值的選擇，盡量選用性質(zhì)相近的土壤如酸性土、石灰性土壤等開展研究。

3.2 pH值和緩沖液對土壤酸性磷酸酶活性的影響

pH值的變化可顯著地改變土壤磷酸酶活性的變化。在酶活性的測定中，pH值的大小通過緩沖液實(shí)現(xiàn)。醋酸鹽緩沖液pH值范圍為3.6～5.8，其中廣泛采用pH值為5測定土壤酸性磷酸酶活性[6,8,17]。但本研究發(fā)現(xiàn)，隨緩沖液pH值的增加，土壤酸性磷酸酶活性呈較劇烈的上升，并沒有支持采用pH值為5的醋酸鹽緩沖液為最適環(huán)境條件的結(jié)論。此外，在醋酸鹽緩沖液條件下，用不同pH值范圍測定的不同土樣之間土壤酸性磷酸酶活性變異系數(shù)劇烈變化：即在緩沖條件為pH值5或6時(shí)變異系數(shù)分別為0.52和0.60，而在pH值為4時(shí)的變異系數(shù)為1.08。這在一定程度上影響著數(shù)據(jù)的可比性。

檸檬酸鹽緩沖液作為主要的酸性緩沖液，其pH值范圍在3.0～6.6之間。如果把pH值為5看作是一個(gè)最適的pH值，只有檸檬酸鹽緩沖液有這種現(xiàn)象，即土壤酸性磷酸酶活性在緩沖液pH值由4到5環(huán)境條件下呈上升趨勢，而在pH值由5到6時(shí)呈下降趨勢。就不同土樣酸性磷酸酶活性變異系數(shù)而言，在不同pH值范圍內(nèi)的變化幅度較醋酸鹽緩沖液條件低但高于MUB緩沖液。

MUB是一種廣譜緩沖液，緩沖液pH值范圍是2.6～12.0[14]。在酸性磷酸酶活性的測定中，通常認(rèn)為pH值6.5時(shí)，土壤酸性磷酸酶活性最高[18]。從表3數(shù)據(jù)來看，也有個(gè)別土壤的酸性磷酸酶活性并沒有隨著pH值增加呈上升趨勢，這在一定程度上說明pH值6.5并不是所有土壤的最適pH值，在選定的3種緩沖液中，MUB緩沖液條件下土壤酸性磷酸酶活性變異系數(shù)在0.80～0.92之間，不同pH值之間的變異系數(shù)的變化趨勢平穩(wěn)，也較其他緩沖液的變異系數(shù)高。因此，MUB緩沖液有利于不同土樣之間數(shù)據(jù)的比較。針對目前不少學(xué)者提出了使用接近待測土壤pH值的緩沖環(huán)境測定土壤磷酸酶的現(xiàn)狀，選用MUB緩沖液應(yīng)是合理的選擇。

4 結(jié)論

為選擇適宜的測定土壤酸性磷酸酶活性的培養(yǎng)條件，采用3種常用的緩沖液，分別測定了6種不同特征的土壤酸性磷酸酶活性。研究結(jié)果表明，采用MUB緩沖液條件可獲得較穩(wěn)定的土樣區(qū)分序列，且與緩沖液的pH值的變化無關(guān)，而在醋酸鹽緩沖液和檸檬酸鹽緩沖液條件下，不同土樣的酸性磷酸酶區(qū)分度序列受緩沖液pH值影響明顯。就不同土樣之間土壤酸性磷酸酶活性變異系數(shù)而言，醋酸鹽緩沖液和檸檬酸鹽緩沖液條件下，不同pH值范圍獲得的變異系數(shù)變化劇烈；而采用MUB緩沖液獲得的變異系數(shù)較其他緩沖液大，且趨勢平穩(wěn)，有利于不同土樣間數(shù)據(jù)的比較。因此，選用MUB緩沖液測定土壤酸性磷酸酶活性應(yīng)是合理的選擇。針對土壤自身的pH值能顯著影響土壤酸性磷酸酶活性的狀況，在土壤酸性磷酸酶的測定中，應(yīng)進(jìn)一步開展適宜緩沖液和pH值的選擇的研究。