，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)包括鄰苯二甲酸二甲酯(DMP),鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)，鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)，鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)，鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)等，目前全球年產(chǎn)量約為350萬噸，工農(nóng)業(yè)應(yīng)用廣泛.鄰苯二甲酸酯類對動物有致癌、致畸、致突變以及具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾和生殖毒性等效應(yīng)[1-3].近年來，由于各類水體、土壤和大氣中都檢測出較高濃度的PAEs，在水生和陸生動物及人體組織中也有檢測到PAEs的報道，對生態(tài)環(huán)境和人體健康都構(gòu)成了極大的危害，PAEs的環(huán)境污染問題已成為國際上環(huán)境化學(xué)優(yōu)先研究領(lǐng)域.

環(huán)境生物與人類健康之間的聯(lián)系是環(huán)境風(fēng)險評估中外推的假定前提條件，有許多在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的機(jī)制，人類與環(huán)境生物在一定程度上也是相重合的.高頻率使用的毒物對環(huán)境生物的毒理學(xué)研究在評估環(huán)境對人類影響的過程中起到“崗哨”作用[4-5].Silvertre采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定中華絨螯蟹受金屬鎘急性和慢性污染后，蟹前腮分別表達(dá)6和31種應(yīng)激蛋白質(zhì)，所獲得的實驗結(jié)果能作為監(jiān)測環(huán)境污染物污染程度的生物標(biāo)志物[6].鼠海豚在鎘鹽脅迫下肝臟中的金屬硫蛋白表達(dá)量異常增加[7].牙鲆受金屬鎘(10 mg/L)脅迫后，其腦組織表達(dá)了24種差異蛋白質(zhì)，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量與污染源中的鎘含量的增加成負(fù)對應(yīng)線性關(guān)系，認(rèn)為轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)遞減率可作為監(jiān)測環(huán)境中金屬鎘污染程度的生物標(biāo)志物[8].蚯蚓對環(huán)境污染物的吸收主要是通過表皮和消化道上皮組織進(jìn)行的，吸收后的污染物會轉(zhuǎn)移到敏感靶位點發(fā)揮毒性作用[9].因而采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定蚯蚓表皮組織受污染物脅迫前后的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，不僅適合于作為監(jiān)測污染程度的生物標(biāo)志物，同時也較為科學(xué)地反映出某區(qū)域內(nèi)污染程度及危害性，并能從蛋白質(zhì)途徑揭示污染物的毒理學(xué)機(jī)理.本實驗以蚯蚓表皮組織為研究材料，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定受DMP污染前后的差異蛋白質(zhì)表達(dá)，為PAEs類污染物在環(huán)境中的風(fēng)險評估和早期監(jiān)測提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，研究工作具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價值.

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT垂直電泳儀、Image Scanner為GE Amersham公司產(chǎn)品，離心機(jī)(Thermo)，超純水儀(Milli Q)，MOLDI-TOF-MS質(zhì)譜由浙江沃森生物科技有限公司檢測.

考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成)，2-D雙向電泳提取試劑盒，Tris，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，甘氨酸，蛋白質(zhì)Marker SM0431(上海生工)，24 cm，PI 4～7預(yù)制膠條和兩性電解質(zhì)(Biorad)，考馬斯亮藍(lán)R250(Amresco)，DTT，瓊脂糖，TEMED，鄰苯二甲酸二甲酯，過硫酸銨，尿素，SDS，甘油，無水乙醇和冰醋酸均為國產(chǎn).

1.2 實驗動物的培養(yǎng)與暴露

將浙江工業(yè)大學(xué)屏峰校區(qū)后山采集的土壤樣品自然風(fēng)干后除去石塊和動植物殘體等異物，樣品過2 mm篩備用.將DMP配成10 g/L，30 g/L的丙酮溶液，將5 mL試劑均勻灑在盛有含8 g經(jīng)研磨后的發(fā)酵干牛糞的200 g土的1 L燒杯中，迅速攪拌，再加入300 g土攪勻，待丙酮自然揮發(fā)干后，調(diào)節(jié)土壤水分含量為最大持水量的40%.平衡24 h后,將清腸約24 h后的蚯蚓再次沖洗干凈，每一燒杯中放入大小相近的15條蚯蚓，并在7,14,21 d后分別取樣雙向電泳.

1.3 體重抑制率

在暴露7,14,21 d后，每個濃度的3組蚯蚓按照OECD指南處理，然后蒸餾水清洗，在濾紙上去除體表水分，稱量.W0為初始蚯蚓平均體重，Wt為t天暴露后的蚯蚓平均體重，體重抑制率=(Wt-W0)/W0×100%.

1.4 雙向電泳

取對照和毒性暴露下的蚯蚓分別在培養(yǎng)皿中用0.9%生理鹽水清腸24 h，蚯蚓加入含0.2% DTT的10% TCA丙酮溶液(溶液和蚯蚓以體積比9∶1)混合冰上研磨，保存于EP管，-20 ℃沉淀過夜，20 000 r/min，4 ℃離心30 min，沉淀重懸于含0.2% DTT的預(yù)冷丙酮，冰浴1 h，20 000 r/min，4 ℃離心30 min，去上清液，取沉淀于冰浴在通風(fēng)櫥中揮發(fā)，加入2-D樣品提取緩沖液1 mL，震蕩重新溶解沉淀，22 000 r/min，20 ℃離心1 h，以Bradford法測蛋白.

將已測定的蛋白樣品與2-D樣品提取液混合，配置蛋白濃度為1.333 g/L的樣品液1 mL，加入10 mg DTT，電解液5 μL，1%溴酚藍(lán)10 μL，震蕩混勻，加入450 μL樣品液于膠條槽中，再將室溫解凍15 min的IPG PI 4～7,24 cm預(yù)制膠條去保護(hù)膜膠面朝下放入膠條槽，覆蓋適量礦物覆蓋油，蓋上蓋子，設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):30 V,12 h;300 V,1 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;2 000 V,1 h;4 000 V,1 h;8 000 V,10 h;500 V,1 h.

聚焦結(jié)束后，IPG膠條平衡兩次，每次15 min，第一步平衡在15 mL平衡液中加入100 mg DTT，使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)；第二步平衡步驟中加入250 mg碘乙酰胺，使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化，將膠條轉(zhuǎn)移至12%SDS凝膠上，并在膠條上方覆蓋一層含有溴酚藍(lán)的1%的瓊脂糖，以10 mA/膠開始電泳30 min后改為20 mA/膠至溴酚藍(lán)染料遷移到膠的底部邊緣結(jié)束電泳.

1.5 蛋白染色與質(zhì)譜鑒定

采用考馬斯亮藍(lán)R250染色，2D-PAGE凝膠層析板中的蛋白質(zhì)斑點采用Image Scanner掃描后，Image Master選取空白膠圖譜蛋白的百分體積為參考，分析暴露后蚯蚓蛋白的表達(dá)差異.

將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)斑點用1 mL或者100 μL滅菌(去尖端)的槍頭切下(大約1 mm3的顆粒)，裝入1.5 mL離心管內(nèi)，進(jìn)行酶解，脫鹽后的蛋白質(zhì)樣品用0.1%甲酸溶解后用于MALDI-TOF MS分析.取1 μL蛋白質(zhì)樣品加到靶點上，待干后加入0.1 μL的基質(zhì)(溶于體積分?jǐn)?shù)為50%TFA中的8 mg/mL α-cyano-4-hydroxcinnamic acid)，進(jìn)行MALDI-TOF-TOF-MS檢測得到肽質(zhì)量指紋圖譜，通過Mascot數(shù)據(jù)搜索，結(jié)合2-D圖譜上初步的蛋白質(zhì)的分子量、等電點信息鑒定蛋白質(zhì).

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓體重抑制率

在許多研究污染物對蚯蚓的影響中，體重抑制率被廣泛的應(yīng)用于環(huán)境風(fēng)險評估和監(jiān)測[10].采用的自然土壤法是一種室內(nèi)模擬的蚯蚓染毒法，能夠較真實的反映土壤環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類對蚯蚓的毒性效應(yīng).圖1為DMP脅迫下的蚯蚓體重抑制率，空白土壤中的蚯蚓起始7 d體重有2.39%增加，隨著時間的延長，蚯蚓覓食難度增加，體重被抑制，21 d體重抑制率最大僅為6.25%；而暴露在含DMP下的土壤，蚯蚓通過減少覓食，減低新陳代謝來適應(yīng)不良環(huán)境，隨著時間的延長其體重抑制率變大，21 d暴露在DMP質(zhì)量濃度為600 mg/kg自然土壤下的蚯蚓體重抑制率達(dá)21.93%；同一時間，暴露在600 mg/kg質(zhì)量濃度下的蚯蚓抑制率較高于暴露在200 mg/kg質(zhì)量濃度下的蚯蚓(7 d時，體重抑制率持平).研究顯示DMP在長期暴露或含量較高的條件下對蚯蚓的生長具有不同程度的抑制作用,這種生長緩慢的作用可能與蚯蚓的一種生存策略有關(guān),即減少食物的攝取,減低新陳代謝率來適應(yīng)不良環(huán)境[11],從而規(guī)避DMP帶來的危害.

圖1 DMP脅迫下的蚯蚓體重抑制率

2.2 蚯蚓蛋白雙向電泳優(yōu)化分離結(jié)果

比較丙酮/TCA沉淀法和直接裂解法，分別將蚯蚓全蛋白按照600 μg的上樣量，選用PI 4～7,24 cm的線性膠條，12% SDS-PAGE進(jìn)行雙向電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色.實驗結(jié)果表明：丙酮/TCA沉淀法得到背景清晰，其全蛋白具有較高分辨率，分布趨勢均勻，大分子和小分子蛋白都有較好的分離。采用改良TCA-丙酮法處理能有效分離蚯蚓全蛋白，也適于開展后續(xù)的研究分析.

2.3 差異蛋白分析結(jié)果

圖2 DMP脅迫下7天赤子愛勝蚓雙向電泳圖譜

凝膠掃描后，用Image master雙向凝膠電泳圖像分析軟件對實驗組和對照組蚯蚓蛋白2D凝膠電泳圖譜進(jìn)行差異蛋白的比較分析發(fā)現(xiàn)，共有140個差異蛋白點.圖2為DMP脅迫下7天赤子愛勝蚓雙向電泳圖譜，被圈出的蛋白點為和對照組相比，表達(dá)豐度差異在70%以上的差異蛋白點.

2.4 差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索分析

選擇定量分析中表達(dá)豐度差異在70%以上pI 4～5之間的6個蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜，獲得的蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜，輸入Mascot查詢系統(tǒng),結(jié)果成功鑒定了5個差異蛋白質(zhì)點，表1為差異蛋白點R13的質(zhì)譜報告，其為α微管蛋白，分子量為46 770.2 Da，等電點PI為5.23.根據(jù)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中提供的所鑒定蛋白質(zhì)的功能注釋，蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果見表2.

表1 差異蛋白點R13的質(zhì)譜報告

表2 MALDI-TOF-MS鑒定的5個差異蛋白質(zhì)斑點

研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出差異表達(dá)的140個蛋白質(zhì)斑點，并用肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫比對法初步鑒定出5種差異蛋白質(zhì)，分別為假定蛋白(BRAFLDRAFT_58397),α微管蛋白，ATP合酶β亞基，β微管蛋白，假定蛋白(FAEPRAM212_03570).

假定蛋白(BRAFLDRAFT_58397)區(qū)域2—432個氨基酸為alpha_tubulin.Tubulin即微管蛋白，是一種細(xì)胞骨架蛋白，細(xì)胞質(zhì)中微管在細(xì)胞分裂前期解聚重組成紡錘絲參與細(xì)胞分裂，在不同的物種和細(xì)胞，其表現(xiàn)為相似的成分組成、分子量和聚合能力，然而，在同一個細(xì)胞，tubulin也存在多種類型[12-13]，可為α,β,γ,δ,ε等多種tubulin，其中alpha tubulin和beta tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種tubulin.蚯蚓暴露在DMP質(zhì)量濃度為200 mg/kg的自然土壤下7天alpha tubulin表達(dá)量為空白的1.9倍，其表達(dá)異常增加，可能說明，在鄰苯二甲酸二甲酯脅迫下，蚯蚓細(xì)胞表現(xiàn)為有絲分裂活躍.α微管蛋白分子量46 770.2 Da,PI 5.23較假定蛋白(BRAFLDRAFT_58397)分子量和等電點有些許區(qū)別，在同一個體不同細(xì)胞中alpha tubulin解聚和重組后，三維架構(gòu)有一定的差別從而檢測PI和分子量有區(qū)別.蚯蚓暴露在DMP質(zhì)量濃度為200 mg/kg的自然土壤下14天alpha tubulin表達(dá)量為空白的2.67倍；蚯蚓暴露在DMP質(zhì)量濃度為200 mg/kg的自然土壤下14天β微管蛋白表達(dá)量為空白的2.44倍，其表達(dá)異常增加，該組也表現(xiàn)為細(xì)胞有絲分裂活躍，可能為細(xì)胞癌變.

ATP合酶β亞基(ATP synthase beta subunit)區(qū)域2—52為ATP-synt_ab_N結(jié)構(gòu)域，區(qū)域54—333為F1-ATPase_beta.ATP合酶是利用跨膜質(zhì)子泵催化ADP和磷酸反應(yīng)生成ATP的一類蛋白復(fù)合體.在線粒體中存在的主要是F1-F0型ATP合酶，它由膜外可溶性的球形結(jié)構(gòu)域F1和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域F0組成.蚯蚓暴露在DMP質(zhì)量濃度為200 mg/kg的自然土壤下14天ATP合酶β亞基表達(dá)量為空白的3.21倍，其表達(dá)異常增加，在沒有任何癥狀的早期階段，蛋白質(zhì)水平已經(jīng)表現(xiàn)出一系列的與細(xì)胞癌變相關(guān)的變化.

假定蛋白(FAEPRAM212_03570)區(qū)域209—357為COG2932，可能作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，區(qū)域260—356為S24_LexA-like，肽S24_LexA-like參與SOS修復(fù)反應(yīng)，修復(fù)單鏈DNA.蚯蚓暴露在DMP質(zhì)量濃度為200 mg/kg的自然土壤下7天FAEPRAM212_03570表達(dá)量為空白的4.26倍，其表達(dá)異常增加，我們推測，該組蚯蚓在覓食和皮膚接觸過染毒土壤后，自身機(jī)體產(chǎn)生免疫修復(fù)作用，亦或細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程異常，機(jī)體自身產(chǎn)COG2932調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄.

2D電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離總蛋白的重要技術(shù).由于2D電泳技術(shù)本身的限制因素，如堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流(EOF)的產(chǎn)生，對堿性蛋白質(zhì)和低豐度蛋白質(zhì)的分離效果不理想等,一些差異蛋白可能未被鑒定出來.加之目前模式生物蚯蚓的蛋白數(shù)據(jù)庫還遠(yuǎn)不完善,一些鑒定出的差異蛋白具體處在代謝路徑或者信號通路的哪個節(jié)點還不得而知,此外，它們在鄰苯二甲酸二甲酯壓迫過程中的作用還有待進(jìn)一步研究.

3 結(jié) 論

以蚯蚓為模式生物研究鄰苯二甲酸二甲酯的毒性作用，采用自然土壤法模擬蚯蚓染毒法，在受到污染脅迫下蚯蚓體重有顯著的抑制，進(jìn)而采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫比對法初步鑒定出5種差異蛋白質(zhì)，分別為假定蛋白(BRAFLDRAFT_58397),α微管蛋白，ATP合酶β亞基，β微管蛋白，假定蛋白(FAEPRAM212_03570)，這些蛋白質(zhì)可能參與鄰苯二甲酸二甲酯代謝并與蚯蚓解毒功能有關(guān)，有望成為土壤生態(tài)毒性評價、監(jiān)測和開展毒理學(xué)研究的生物大分子標(biāo)記物.

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