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(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032)

竹子是禾本科(Poaceae),竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，在我國具有悠久的食用和藥用歷史.全世界竹子約有70多屬、1 250多種，其中53%分布在中國.竹葉黃酮是一種有獨(dú)特天然竹香的天然抗氧化劑，其抗氧化作用可替代銀杏提取物、茶葉提取物和葡萄籽提取物，已列入國標(biāo)GB 2760-2011，被衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為天然食品抗氧化劑使用.竹葉黃酮具有清除自由基、抗氧化、防衰老和預(yù)防老年癡呆[1]，抗炎[2-3]，殺菌[4-6]，預(yù)防癌癥，抗腫瘤增殖[7]，降低血糖[8]，降低心腦血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)[9]等多種生物學(xué)功效.研究表明竹葉含有相當(dāng)高含量的碳苷黃酮，如葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷(本實(shí)驗(yàn)室采用LC-DAD-MS/MS技術(shù)鑒定)、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷[10].然而，剛竹屬不同品種竹葉中6種碳苷黃酮含量方面的研究還沒有報(bào)道，為找到富含竹葉黃酮的竹類資源，本研究建立測(cè)定6種碳苷黃酮的HPLC法，對(duì)剛竹屬15種竹子中的碳苷黃酮進(jìn)行定量分析，為充分開發(fā)利用富含碳苷黃酮的竹類資源提供科學(xué)基礎(chǔ).

1 儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)，YP202N電子天平(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，F(xiàn)D-2密封式恒溫可調(diào)電加熱器(嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司).15種剛竹屬(PhyllostachysSieb.etZucc)竹葉(P.pubescens,P.vivax,P.arcana,P.nidularia,P.rubicunda,P.aurea,P.meyeri,P.circumpilis,P.acuta,P.bambusoides,P.tianmuensis,P.glauca,P.rubromarginata,P.heterocycla,P.nigra)于2012年10月采自浙江安吉竹博園.標(biāo)準(zhǔn)品葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷購自上海同田生化有限公司，色譜純乙腈和甲醇購自美國TEDIA天地試劑公司，水為超純水，其他試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，樣品進(jìn)樣前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相混合溶劑A(乙腈)和溶劑B(體積分?jǐn)?shù)0.2%乙酸水)梯度洗脫條件：10% A(34 min)，10%～13% A(34～52 min),13%～15% A(52～85 min)；15%～10% A(85～90 min)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長330 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL.在上述色譜條件下，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5(圖1)，理論塔板數(shù)均大于5 000.

1—葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷；2—葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷；3—異葒草苷；4—葒草苷；5—牡荊苷；6—異牡荊苷

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷和葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇溶解，質(zhì)量濃度分別為99.2,76.6,68.8,77.0,79.4和84.3 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備是通過移取一定量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至10 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=15∶85稀釋至刻度，其質(zhì)量濃度范圍為0.20～100 μg/mL，8個(gè)梯度質(zhì)量濃度.

2.3 樣品溶液的制備

取新鮮干燥竹葉置50 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎成細(xì)粉.精密稱取1.0 g竹葉干燥粉末置100 mL具塞單口瓶中，加入70%甲醇15 mL，浸潤2 h，室溫超生提取1 h，經(jīng)離心(4 000 r/min,5 min)后取上清液.按照上述步驟殘?jiān)M(jìn)一步用70%甲醇萃取2次(時(shí)隔40 min)，合并所有的提取液，在真空下濃縮后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解并稀釋至刻度，4 ℃保存.樣品進(jìn)樣前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

HPLC色譜梯度條件優(yōu)化之后，通過線性關(guān)系考察、最低檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度和準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證.

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC方法學(xué)驗(yàn)證

HPLC色譜方法通過最低檢測(cè)限、定量限、線性關(guān)系、日內(nèi)精密度、日間精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，6種碳苷黃酮的最低檢測(cè)限范圍為0.003 5～0.146 5 μg/mL，最低定量限的范圍為0.012 4～0.493 9 μg/mL，保留時(shí)間(tR)和峰面積(PA)的RSD分別低于0.19%(tR)，3.36%(PA).方法的重復(fù)性RSD低于2.91%，其準(zhǔn)確性即回收率范圍為97.9%～101.0%.6種碳苷黃酮的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)如表1所示，所有化合物的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 7.上述結(jié)果表明：本研究所建立的同時(shí)，檢測(cè)竹葉中6種碳苷黃酮的HPLC方法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠.

表1 黃酮類化合物的線性關(guān)系

3.2 樣品測(cè)定

剛竹屬15種竹葉按照2.3項(xiàng)下方法制備成供試樣品，于2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，其結(jié)果如表2所示.15種竹葉樣品中葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷、異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷及其6種碳苷黃酮的總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為：27.5～233.5，15.9～192.9，132.9～953.4，47.6～331.6，9.8～153.0，2.9～179.5，480.7～1 719.9 μg/g.分析結(jié)果表明：毛竹、淡竹、天目早竹、龜甲竹和斑竹富含竹葉黃酮類化合物，以毛竹葉中碳苷黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最高，達(dá)到1 719.9 μg/g.

表2 剛竹屬15種竹葉中6種黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1)

4 結(jié) 論

竹葉碳苷黃酮具有清除自由基、抗氧化、降血糖、抗炎、殺菌、保肝、護(hù)肝、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種生物學(xué)功效，因此以竹葉中6種碳苷黃酮的含量為指標(biāo)，建立的HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定15種竹葉中6種碳苷黃酮的含量，具有科學(xué)性且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可被廣泛使用.分析結(jié)果表明：毛竹、淡竹、天目早竹、龜甲竹和斑竹5種竹子富含碳苷黃酮類化合物,可作為碳苷黃酮的主要來源.這種方法為竹葉資源的深層次開發(fā)和綜合利用提供了一定的研究基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)我國農(nóng)林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大的指導(dǎo)意義.

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