王學(xué)東，李桂南，李明陽(yáng)

(華東理工大學(xué)a.生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

腈類化合物是一類非常重要的化合物。腈類物質(zhì)的水解反應(yīng)在氨基酸、酰胺、羧酸以及它們的衍生物的合成中有著非常廣泛的應(yīng)用［1－4］。

對(duì)腈類物質(zhì)水解的方法有化學(xué)水解法和酶法2種。化學(xué)水解法一般需要滿足強(qiáng)酸(或強(qiáng)堿)、高溫、高壓等比較劇烈的反應(yīng)條件，效率低、成本高，同時(shí)也造成了相當(dāng)?shù)沫h(huán)境壓力。而酶法水解則具有反應(yīng)條件溫和、高效、專一、成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)［5－7］。

由于天然腈類化合物的存在，許多微生物都有轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)的能力。從20世紀(jì)60年代開始，人們從假單孢菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)、克雷伯氏菌(Klebsiella)中發(fā)現(xiàn)并得到了腈水解酶［8］。近年來(lái)，隨著宏基因組技術(shù)的快速發(fā)展，人們從自然環(huán)境中獲得了大量未培養(yǎng)微生物的基因組，其中已測(cè)序的腈水解酶基因也大量出現(xiàn)，這就為腈水解酶的進(jìn)一步研究提供了更多材料。

利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建具有腈水解酶活性的新型基因工程菌株，可以在不同程度上解決生產(chǎn)中遇到的許多問(wèn)題，如提高酶的表達(dá)水平、增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性、減少副反應(yīng)的發(fā)生等。1987年，Stalker等［8］首次在克雷伯氏菌中克隆得到腈水解酶的基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)重組腈水解酶的研究日益增多，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道卻比較少。國(guó)內(nèi)王清路等［9］研究了腈水解酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)，羅暉等［10］和劉俊峰等［11］分別研究了腈水解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自有腈水解酶產(chǎn)生菌為基礎(chǔ)，通過(guò)簡(jiǎn)并PCR和染色體步移的方法得到該菌株的腈水解酶基因，然后進(jìn)行了異源表達(dá)，為進(jìn)一步在分子水平上對(duì)該腈水解酶進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

渾球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides LHS-305由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選并保存，現(xiàn)保藏于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M209065。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、Rosetta(DE3)為華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq DNA聚合酶、LA-Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶等購(gòu)自Takara公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司。引物由上海英駿公司合成。

1.2 腈水解酶部分基因序列片段的PCR擴(kuò)增

1.2.1 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)

從NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索腈水解酶基因的相關(guān)蛋白質(zhì)序列，并對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，最終基于氨基酸保守區(qū)G(A/Q)L(C/A)CWEH設(shè)計(jì)出正向簡(jiǎn)并引物NIT-CWEH:5'-GGC GCC CTG TGC TGY KBI GAR CA-3'(簡(jiǎn)并度:96，Tm 值:63.9℃)，基于氨基酸保守區(qū)G(H/N)YARP(D/E)(V/L)設(shè)計(jì)出反向簡(jiǎn)并引物NIT-ARPDER:5'-CGT CGG GCC GGG CRT ART KIC C-3'(簡(jiǎn)并度:32，Tm 值:61.3℃)。

1.2.2 腈水解酶基因保守區(qū)域的擴(kuò)增

以Rhodobacter sphaeroides LHS-305基因組DNA為模板，利用根據(jù)腈水解酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物NIT-VFPE和NIT-FDT以及NIT-CWEH和NIT-ARPDER進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)使用Touch-Down PCR方法:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，退火是從65℃下降到50℃，時(shí)間為1 min，每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);然后在94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸30 s，共15個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.3 染色體步移得到保守區(qū)域上下游序列

參照文獻(xiàn)［12］設(shè)計(jì)2個(gè)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1和 AD2，根據(jù)上一步得到的 Rhodobacter sphaeroides LHS-305腈水解酶基因的部分片段設(shè)計(jì)3個(gè)正向的嵌套步移引物(分別為SP1、SP2、SP3)和3個(gè)反向的嵌套步移引物(分別為 SP4、SP5、SP6)，見(jiàn)表1。

表1 染色體步移使用的引物

用引物SP1/SP4和AD1/AD2按照表2中的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物稀釋10倍作為模板。使用引物SP2/SP5和AD1/AD2進(jìn)行第2輪巢式PCR擴(kuò)增，再將其產(chǎn)物稀釋10倍作為模板。使用引物SP3/SP6和AD1/AD2進(jìn)行第3輪巢式PCR擴(kuò)增。將第3輪巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆后測(cè)序。對(duì)克隆得到的序列進(jìn)行拼接，得到完整腈水解酶基因序列。

表2 染色體步移的PCR反應(yīng)條件

1.4 腈水解酶基因全長(zhǎng)的克隆和簡(jiǎn)單序列分析

根據(jù)拼接得到的腈水解酶基因全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)上游引物NIT-F:5'-GGAATTCCATATGCCCAAGACAGTACGTGC-3'(下劃線部分為NdeI酶切位點(diǎn))和下游引物NIT-R:5'-AACAAGCTTTCACGCATCCTGGGCCTC-3'(下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn))用于完整開放閱讀框的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)使用具有高保真擴(kuò)增效果的PrimeSTAR?HS DNA聚合酶，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃繼續(xù)延伸10 min。將獲得的全長(zhǎng)腈水解酶基因提交Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)。

將測(cè)序得到的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast程序?qū)υ摰鞍踪|(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 腈水解酶基因的表達(dá)

1.5.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物切膠回收后用NdeI和HindⅢ雙酶切，連接到同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-nit，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒DNA，用 NdeI和HindⅢ雙酶切驗(yàn)證篩選得到陽(yáng)性克隆。提取驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)，得到腈水解酶的基因工程菌株。

1.5.2 腈水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組菌Rosetta/pET28a-nit和對(duì)照菌Rosetta/pET28a分別接種于5 mL含有50 μg/mL卡那霉素、34 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，1%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.4 ～0.6 時(shí)加 入 IPTG(終濃度為0.2 mmol/L)，20℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 h左右，離心收集菌體。用10 mM磷酸鈉緩沖液(pH值為7.0)清洗數(shù)次，取0.5g濕菌體催化20 mM 3-氰基吡啶反應(yīng)30 min，將反應(yīng)液15 kg離心10 min，取上清，用HPLC方法檢測(cè)重組菌活力。檢測(cè)條件:柱子為 Agilent Zorbax SB-Aq，流動(dòng)相為甲醇/0.1%磷酸=20/80，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 腈水解酶基因保守區(qū)域的獲得

以提取的Rhodobacter sphaeroides LHS-305基因組DNA為模板，利用引物 NIT-VFPE和NITFDT，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后沒(méi)有得到預(yù)期大小的目的條帶。

而利用引物 NIT-CWEH和 NIT-ARPDER，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后則得到了目的大小的部分腈水解酶基因的序列，保守序列的瓊脂糖電泳分析如圖1所示。回收400 bp左右的目的大小片段，并將其克隆至載體pMD19-T Simple中，測(cè)序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小為402 bp。BLAST比對(duì)分析表明:該片段與庫(kù)中已知的腈水解酶核苷酸序列最大相似性為83%。

圖1 保守序列的瓊脂糖電泳分析

2.2 保守區(qū)域上下游序列的獲得

以 SP1/SP4、SP2/SP5、SP3/SP6為特異性引物，AD1、AD2為隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，利用巢式PCR方法，經(jīng)過(guò)3輪PCR反應(yīng)，分別克隆得到上述已知片段的上下游序列，結(jié)果如圖2所示。

2.3 腈水解酶全長(zhǎng)基因的獲得和序列分析

將Rhodobacter sphaeroides LHS-305腈水解酶基因部分片段及上下游序列拼接，得到了該菌株完整的腈水解酶基因序列，長(zhǎng)度為969 bp。將該基因序列提交Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列的登錄號(hào)為JN635494，推測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)為322 aa，理論分子量為35426 Da，理論等電點(diǎn)為6.01。

將該腈水解酶基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Rhodobacter sp.LHS-305腈水解酶與Agrobacterium sp.H13-3(Genebank登錄號(hào):ADY67983.1)有最高的核苷酸序列相似性，為82%。此外，與同屬中其他腈水解酶基因序列的相似性很低(最高只有38.4%)。

圖2 保守區(qū)域上游(a)和下游(b)序列的瓊脂糖電泳分析

將DNA序列翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，比對(duì)結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)該腈水解酶與已經(jīng)報(bào)道的Synechocystis sp.PCC 6803 的同源性為 60.2%，與Pseudomonas fluorescens Pf-5的同源性為30.7%，與同屬中其他腈水解酶蛋白質(zhì)序列相似性最高只有17.2%，這一結(jié)果也很好地解釋了根據(jù)同菌屬腈水解酶保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物沒(méi)能克隆得到目的片段的原因。

圖3 Rhodobacter sphaeroides LHS-305腈水解酶基因片段的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.4 腈水解酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組菌株Rosetta/pET28a-nit按本文的方法誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)得到的菌液超聲破碎后，取上清通過(guò)15%SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。圖4中可在40 kD附近看到1條清晰的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的腈水解酶大小吻合。其蛋白表達(dá)量較高，約占菌體可溶蛋白總量的40%。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析

構(gòu)建好的重組菌催化3-氰基吡啶反應(yīng)30 min后，通過(guò)HPLC方法，檢測(cè)到大部分底物3-氰基吡啶(出峰時(shí)間為13.2 min)已經(jīng)轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物尼克酸(出峰時(shí)間為4.9 min)，如圖5所示。對(duì)構(gòu)建好的重組菌利用鎳柱親和層析的方法得到了純的腈水解酶，該酶對(duì)多種腈類底物均表現(xiàn)出了較高的催化活力。在pH值為7.0、40℃條件下，該酶催化3-氰基吡啶反應(yīng)的速率為 15.7 μmol·min－1·mg－1。

圖5 重組腈水解酶菌株對(duì)3－氰基吡啶轉(zhuǎn)化結(jié)果的HPLC圖譜

3 結(jié)束語(yǔ)

本文從華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行篩選得到的菌株Rhodobacter sphaeroides LHS-305(CCTCC M209065)中克隆出1個(gè)新的腈水解酶基因，其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知腈水解酶基因的最高核苷酸序列相似性為82%，與已知紅細(xì)菌屬中的腈水解酶基因最高核苷酸序列相似性為38.4%，但與最高氨基酸序列相似性只有17.2%。成功構(gòu)建了表達(dá)載體 pET28a-nit，并在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行了高效表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE方法檢測(cè)到目的蛋白得到成功表達(dá)。通過(guò)催化3－氰基吡啶反應(yīng)，驗(yàn)證了重組菌和純化后的重組酶的催化活力。

［1］Banerjee A，Kaul P，Banerjee U C.Purification and characterization of an enantioselective arylacetonitrilase from Pseudomonas putida［J］.Arch Microbiol，2006，184:407－418.

［2］Singh R，Sharma R，Tewari N，et al.Nitrilase and its application as a‘green’catalyst［J］.Chem Biodiversity，2006，3:1279 －1287.

［3］Brady D，Dube N，Pettersen R.Green chemistry:highly selective biocatalytic hydrolysis of nitrile compounds［J］.S Afr J Sci，2006，102:339 －344.

［4］Martinkova L，Kren V.Nitrile-and amide-converting microbial enzymes:stereo-，regio-and chemoselectivity［J］.Biocatal Biotransform，2002，20:73 －93.

［5］Martinkova L，Mylerova V.Synthetic applications of nitrile-converting enzymes［J］.Current Organic Chemistry，2003，7(13):1279 －1295.

［6］Banerjee A，Sharma R，Banerjee U.The nitrile-degrading enzymes:current status and future prospects［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60:33 －44.

［7］徐建妙，鄭裕國(guó)，沈寅初.腈水解酶的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(5):141－146.

［8］Stalker D M，Mcbride K E.Cloning and expression in Escherichia coli of a Klebsiella ozaenae plasmid-borne gene encoding a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil［J］.J BIOTECHNOL，1987，169:955 －960.

［9］王清路，張銳，倪萬(wàn)潮，等.透明顫菌血紅蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在畢赤酵母中的表達(dá)研究［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2004，20(5):730 －735.

［10］Hui L，Lu F，Yanhong C，et al.Gene cloning，overexpression，and characterization of the nitrilase from Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 in E.coli［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，160:393 －400.

［11］Liu J，Zhang Z，Li A，et al.Significantly enhanced production of recombinant nitrilase by optimization of culture conditions and glycerol feeding［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，89:665 －672.

［12］應(yīng)革，武威，何朝族.TAIL-PCR方法快速分離Xcc致病相關(guān)基因序列［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2002，18(2):182－186.