張娟娟,李小勤、2,冷向軍、2,韓志英,張飛鴿
(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306;2.農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點試驗室,上海201306)
虹鱒Oncorhynchus mykiss是一種名優(yōu)冷水養(yǎng)殖魚類,具有營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮嫩的特點。虹鱒屬肉食性魚類,對蛋白質(zhì)的需求比較高,虹鱒養(yǎng)殖技術規(guī)范——配合顆粒飼料 SC/T 1030.7—1999[1]中規(guī)定,虹鱒成魚階段的飼料粗蛋白含量≥40%。通常情況下,飼料配方中需要35%~40%的魚粉方可滿足其營養(yǎng)需求。但是,近年來魚粉價格昂貴,資源短缺,為降低養(yǎng)殖成本,有效的方法就是在補充限制性氨基酸的基礎上,以植物性蛋白替代部分魚粉,同時添加酶制劑,如蛋白酶等,以提高植物性蛋白源的利用率。烏蘭等[2]在飼料中添加0.05%、0.10%、0.15%耐高溫酶制劑 (以蛋白酶為主)飼喂奧尼羅非魚56 d,添加量為0.10%時,顯著提高了魚體增重率,降低了飼料系數(shù)。劉鼎云等[3]在魚粉含量為26.4%的飼料中添加175 mg/kg蛋白酶AG,凡納濱對蝦的增重率提高了10.8%,達到了與高魚粉組 (33%魚粉含量)基本一致的增重水平。此外,對鯉[4]、奧尼羅非魚[5]的研究表明,在低魚粉飼料中添加蛋白酶,能促進魚體生長,提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和腸道蛋白酶活性。
目前,有關蛋白酶應用于水產(chǎn)動物方面的報道,主要集中在對溫水性魚類的研究上,而對冷水性魚類的研究相對較少。本試驗中,作者以虹鱒為研究對象,在魚粉含量為35%的飼料 (高魚粉飼料)中,以豆粕和肉骨粉等蛋白源代替20%魚粉,配制低魚粉飼料 (魚粉含量28%),在低魚粉飼料中添加175 mg/kg蛋白酶PT,考察蛋白酶PT對虹鱒生長性能的影響,旨在為蛋白酶在水產(chǎn)飼料中的合理利用提供依據(jù)。
試驗用虹鱒購于黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類試驗站,初始平均體質(zhì)量為 (52.1±0.5)g。選取體質(zhì)健壯、規(guī)格一致的個體135尾,隨機分配于9個自動充氣循環(huán)養(yǎng)殖缸內(nèi) (0.60 m×0.60 m×0.50 m),每缸放15尾魚;共3個處理組,每個處理組設3個重復。
1.2.1 試驗設計及試驗飼料 以魚粉含量為35%的飼料作為高魚粉飼料組;在高魚粉飼料中,用豆粕、肉骨粉替代魚粉制成魚粉含量為28%的飼料作為低魚粉飼料組,同時補充晶體賴氨酸(0.09%)和晶體蛋氨酸 (0.05%),使賴氨酸和蛋氨酸的含量達到與高魚粉組一致的水平;在低魚粉飼料中,添加175 mg/kg蛋白酶PT(加拿大JEFO營養(yǎng)公司生產(chǎn)并提供,為細菌發(fā)酵產(chǎn)物,是一種耐高溫的微堿性絲氨酸蛋白酶)作為蛋白酶飼料組。飼料配方及營養(yǎng)成分組成見表1。各組原料均粉碎并過40目,逐級混合后,由顆粒飼料機(浙江省新昌縣陳氏機械廠生產(chǎn),KL系列)制成粒徑為2.5 mm的硬顆粒沉性飼料,晾干備用。
表1 飼料配方及營養(yǎng)成分組成Tab.1 Ingredients and approximate composition of diet w/%
1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗開始前,將虹鱒暫養(yǎng)3周以適應環(huán)境。試驗正式開始時,3個處理組分別投喂高魚粉飼料、低魚粉飼料和蛋白酶飼料,每天投喂2次 (8:30,15:30),日投飼量為魚體質(zhì)量的1.5%~2.5%,并根據(jù)溫度、攝食和魚體生長情況適當調(diào)整,使各組保持基本一致的攝食水平,以每次投飼后無殘餌為宜。試驗期間水溫為8~14℃,溶氧為6~7 mg/L,pH為7.24~7.78。養(yǎng)殖試驗于上海海洋大學魚類營養(yǎng)實驗室進行,養(yǎng)殖周期為60 d。
1.2.3 生長指標的測定
1)生長性能。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后,魚體饑餓24 h,稱重各組魚,計算增重率、飼料系數(shù)、特定生長率和成活率。
增重率(WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0,
飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0),
特定增長率(SGR,%/d)=100×[ln Wtln W0]/t,
成活率(SR,%)=100×試驗末魚尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù),
其中:Wt為終末平均體質(zhì)量 (g);W0為初始平均體質(zhì)量 (g);F為飼料攝入量 (g);t為飼養(yǎng)時間(d)。
2)肌肉基本成分分析。試驗結(jié)束后,每缸取3尾魚,每個處理組9尾,取背部白肌10 g左右,剪碎成均勻的混合物以測定虹鱒肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。其中,采用105℃恒重法 (GB/T 6435-86)測定水分,采用凱氏定氮法 (GB/T 6432-94)測定粗蛋白,采用氯仿-甲醇抽提法測定粗脂肪,采用550℃灰化法 (GB/T 6438-92)測定粗灰分。
3)胃和腸蛋白酶活力的測定。試驗結(jié)束后,每缸取3尾魚,每個處理組9尾,取腸和胃,于-80℃下保存,待測蛋白酶活力。測定時,在4℃下解凍腸和胃,用4℃去離子水漂洗,用紙吸干,稱重,加入適量4℃緩沖液,剪碎后用勻漿機在冰浴中勻漿,勻漿液在4℃下以8 000 r/min冷凍離心10 min,取上清液測定。其中,胃和胃糜添加0.1 mol/L的KCl-HCl緩沖液 (pH 1.5),腸添加0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液 (pH 8.5)[6]。采用福林酚試劑法測定蛋白酶活力[7]。
胃蛋白酶活力定義:在pH為1.5和40℃水浴中保溫10 min,每g鮮樣組織每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酩氨酸定義為一個酶活力單位 (U)。
腸蛋白酶活力定義:在pH為8.5[8]和40℃水浴中保溫10 min,每g鮮樣組織每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個酶活力單位 (U)。
4)前腸組織切片。采樣時,取前腸于波恩(Bouins)試劑中固定,用體積分數(shù)為100%的酒精沖洗,用不同濃度的酒精脫水,用二甲苯透明、石蠟包埋,固定在木塊上,在切片機上連續(xù)切片(厚度為5 μm),然后貼片、烘片、脫蠟、復水、H.E染色、脫水透明、中性樹膠封片,風干后,于Olympus光學顯微鏡下觀察腸道結(jié)構(gòu)并拍照。
試驗數(shù)據(jù)采用 (平均數(shù)±標準差)表示,用SPSS 17.0進行單因素方差分析,如差異有顯著性,用Duncan氏法進行多重比較,差異顯著性水平設為0.05。
養(yǎng)殖60 d后,各組虹鱒的生長性能見表2。低魚粉組虹鱒的增重率低于高魚粉組 (P<0.05),而飼料系數(shù)卻高于高魚粉組 (P<0.05);蛋白酶組虹鱒的增重率為96.82%,比低魚粉組提高9.42%,飼料系數(shù)為1.41,比低魚粉組降低7.80%;蛋白酶組虹鱒的增重率、飼料系數(shù)與高魚粉組相比均無顯著性差異 (P>0.05);各處理組虹鱒肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量間均無顯著性差異 (P>0.05)(表3)。
表2 對虹鱒生長性能的影響Tab.2 Effects of various diets on growth performance in rainbow trout
表3 對虹鱒肌肉成分的影響Tab.3 Effects of different diets on muscular approximate composition in rainbow trout w/%
從表4可見:高魚粉組和蛋白酶組虹鱒腸蛋白酶和胃蛋白酶活力均高于低魚粉組 (P<0.05),但蛋白酶組、高魚粉組虹鱒腸蛋白酶和胃蛋白酶活力間無顯著性差異 (P>0.05)。
表4 對虹鱒腸、胃蛋白酶活力的影響Tab.4 Effects of different diets on intestinal and gastric protease activities in rainbow trout U/g
對虹鱒前腸組織切片,觀察并測量前腸皺襞高度和面積。由表5可見,高魚粉組和蛋白酶組前腸皺襞高度和面積均高于低魚粉組 (P<0.05),但高魚粉組、蛋白酶組的前腸皺襞高度和面積均無顯著性差異 (P>0.05)。從圖1-A、C可見,高魚粉組和蛋白酶組腸絨毛發(fā)達,排列整齊完整,固有層結(jié)締組織、黏膜肌和腸絨毛連接緊密;從圖1-B可見,低魚粉組腸絨毛的高度低于高魚粉組和蛋白酶組 (P<0.05),部分腸絨毛與黏膜肌分離,黏膜肌和結(jié)締組織較疏松,腸絨毛變短且前端有損傷。
圖1 虹鱒前腸組織結(jié)構(gòu) (×4)Fig.1 The tissue structure of foregut in rainbow trout(×4)
表5 蛋白酶對虹鱒前腸組織結(jié)構(gòu)的影響(n=6)Tab.5 Effects protease addition on the structure of foregut tissue in rainbow trout(n=6)
Cheng等[9]和 Gaylord 等[10]的研究均表明,虹鱒能夠有效利用飼料中添加的外源晶體氨基酸。但在本試驗中,低魚粉飼料補充賴氨酸、蛋氨酸后,盡管其賴氨酸、蛋氨酸達到與高魚粉組一致的水平,但虹鱒的魚體增重率仍顯著低于高魚粉組,僅相當于高魚粉組的89.8%(表2),而飼料系數(shù)卻顯著升高。這說明,以植物蛋白、肉骨粉部分代替魚粉后,單純通過補充限制性氨基酸,仍難以達到理想的生長效果,其原因可能與植物蛋白、肉骨粉的消化率低以及缺乏一些未知生長因子等 (相對于魚粉而言)有關[11-12],因此,通過在飼料中添加酶制劑,提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率,是減少魚粉用量,提高替代蛋白源利用率的有效途徑。
蛋白酶是催化分解肽鍵的一類酶的總稱,能將蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白胨、肽和氨基酸,從而提高蛋白質(zhì)的消化利用率。冷向軍等[13]在魚粉含量為10%的飼料中添加175 mg/kg蛋白酶AG后,鯉增重率提高9.1%,飼料系數(shù)降低9.9%,同時也提高了腸道蛋白酶活性;烏蘭等[14]在對奧尼羅非魚的研究中,添加0.1%的金屬蛋白酶,可提高前腸蛋白酶活力18.83%,腸道皺襞高度也得到顯著提高;Drew等[15]用豌豆替代魚粉,添加 250 mg/kg蛋白酶后,虹鱒攝食量顯著增加,飼料系數(shù)顯著降低;此外,蛋白酶應用在肉仔雞[16]、仔豬[17]、奶 牛[18]、異育銀鯽[19]、 草 魚[20]、 黃 顙魚[21]等的研究均表明,蛋白酶具有促進動物生長、降低飼料系數(shù)、改善腸道組織結(jié)構(gòu)、提高消化酶活性和飼料利用率的作用。添加外源性消化酶提高消化道酶活性的原因,一方面可能是外源性消化酶直接參與對飼料成分的分解,另一方面可能是促進了內(nèi)源性消化酶的分泌,與外源酶共同作用,從而提高魚體對營養(yǎng)成分的消化和吸收,促進魚體生長。
本試驗中,低魚粉飼料組的虹鱒增重率及腸、胃蛋白酶活性最低,前腸組織學觀察也表明腸絨毛有部分損傷,這來源于植物蛋白相對較低的消化率及抗營養(yǎng)因子的危害;在低魚粉飼料中添加175 mg/kg蛋白酶后,虹鱒增重率、飼料系數(shù)均得到了改善,雖未達到顯著水平,但與高魚粉組相比,已無顯著性差異;此外,虹鱒腸、胃蛋白酶的活性有顯著提高,腸絨毛發(fā)達且排列整齊,皺襞高度和面積顯著增加,增加了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積,這說明蛋白酶的添加能促進虹鱒腸道結(jié)構(gòu)的改變,提高虹鱒對飼料的消化吸收率,從而促進其生長。
[1]魏立賢,宋蘇祥.虹鱒養(yǎng)殖技術規(guī)范[S].武漢:中國水產(chǎn)科學院長江水產(chǎn)研究所,1999:362-366.
[2]烏蘭,齊景偉,謝俊.耐高溫酶制劑對奧尼羅非魚生長和消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)科學,2009,28(10):579-582.
[3]劉鼎云,冷向軍,盧永紅,等.飼料中添加蛋白酶AG對凡納濱對蝦生長和肌肉成分的影響[J].飼料工業(yè),2007(20):24-25.
[4]劉鼎云,冷向軍,盧永紅,等.飼料中添加蛋白酶Aquagrow對鯉生長和蛋白質(zhì)消化酶活性的影響[J].淡水漁業(yè),2007,37(5):50-52.
[5]烏蘭,謝駿,王廣軍.金屬蛋白酶對奧尼羅非魚生長、消化率及非特異性免疫功能的影響[J].南方水產(chǎn),2007,3(3):8-13.
[6]Hidalgo M C,Urea E,Sanz A.Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits.Proteolytic and amylase activities[J].Aquaculture,1999,170:267-283.
[7]Walter H E.Proteinases:methods with hernoglobill,casein and azocoll as substrates[M]//Bergmeyer H U.Methods of Enzymatic A-nalysis,Vol.V.Verlag Chemie.Weinheim,1984:270-277.
[8]Furné M,Hidalgoa M C,Lopeza A,et al.Digestive enzyme activities in Adriatic sturgeon Acipenser naccarii and rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J].Aquaculture,2005,250(1-2):391-398.
[9]Cheng Z J,Ronaiht W H,James L U.Effect of lysine supplementation in plant protein-based diets on the performance of rainbow trout and apparent digestibility coefficients of nutrients[J].Aquaculture,2003,215:255-265.
[10]Gaylord T G,Barrows F T,Teague A M,et al.Supplementation of taurine and methionine to all-plant protein diets for rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Aquaculture,2007,269:514-524.
[11]崔敏,郭冉,夏輝.用飼料酵母替代魚粉對大菱鲆幼魚生長及免疫機能的影響[J].大連海洋大學學報,2012,27(1):58-63.
[12]賈鐘賀,王常安,徐奇友,等.高蛋白和高脂肪飼料對二倍體與三倍體山女鱒生長性能和營養(yǎng)成分的影響[J].大連海洋大學學報,2010,25(4):337-343.
[13]冷向軍,劉鼎云,李小勤,等.飼料中添加蛋白酶AG對鯉魚魚種生長和蛋白質(zhì)消化酶活性的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2008,20(3):268-274.
[14]烏蘭.耐高溫酶制劑對奧尼羅非魚生長性能、消化酶和非特異性免疫及腸道組織的影響[D].上海:上海水產(chǎn)大學,2007.
[15]Drew M D,Racz V J,Gauthier R,et al.Effect of adding protease to coextruded flax:pea or canola:pea products on nutrient digestibility and growth performance of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Animal Feed Science and Technology,2005,119:117-128.
[16]萬振環(huán),袁建敏,咼于明,等.蛋白酶和植酸酶聯(lián)合添加降低肉仔雞氮磷排放的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2009,14(5):80-85.
[17]盧晨,邊連全,劉顯軍,等.中性和酸性蛋白酶對斷奶仔豬生長性能的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2009,21(6):993-997.
[18]劉大程,程艷,盧德勛,等.高活性生物蛋白酶(Power-cell)對患隱性乳房炎奶牛生產(chǎn)性能的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(7):81-83.
[19]劉文斌,王恬.棉粕蛋白酶解物對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)消化、生長和胰蛋白酶mRNA表達量的影響[J].海洋與湖沼,2006,37(6):568-574.
[20]王紀亭,萬文菊,康明江,等.復合酶制劑對草魚生長性能、飼料養(yǎng)分消化率及免疫力的影響[J].大連水產(chǎn)學院學報,2009,24(5):417-422.
[21]韓慶,夏維福,羅玉雙,等.酶制劑對黃顙魚生長性能的影響[J].水產(chǎn)學雜志,2002,15(1):84-87.