王 燕，金 楊，劉振琪*

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000；2.大理州中醫(yī)醫(yī)院，云南大理 671000）

巖陀為虎耳草科植物西南鬼燈擎Rodgersia sambucifolia Hemsl.或羽葉鬼燈擎Rodgersia pinnata Hemsl.的干燥根莖〔1〕，具有收斂、消炎、祛風除濕的功效，對菌痢、腸炎、感冒頭痛、外傷出血、風濕骨痛、老年性支氣管炎等常見疾病有較好的療效〔2〕，在民間應用廣泛。巖白菜素（bergenin）為巖陀的主要有效成分。巖白菜素有止咳作用，中國藥典收為鎮(zhèn)咳祛痰藥，用于慢性支氣管炎，文獻曾報道巖白菜素還有抗炎、抗?jié)?、護肝、抗凝血、抗HIV病毒和提高免疫能力及鎮(zhèn)痛等作用〔3〕。因此進一步開發(fā)利用巖陀具有重要的社會價值。目前，對巖陀中巖白菜素的提取工藝缺乏系統(tǒng)研究，本文通過正交試驗法對其提取工藝進行探討〔4〕。

1 儀器與試藥

LC-20AD型HPLC系統(tǒng)，包括CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC solution工作站（日本島津公司）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205型梅特勒電子天平（上海亞榮生化儀器廠）；中藥材粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）。所用藥材購自云南大理，由貴州省藥品檢驗所陳德媛研究員鑒定為真品；巖白菜素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1532-200202）；HPLC所用乙腈為色譜純，其它試劑為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為274 nm（ 對照品紫外光譜掃描圖見圖1），流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，流動相為乙腈-0.1%磷酸（10∶90）。 理論塔板數(shù)按巖白菜素峰計不得少于4000。對照品及樣品色譜圖見圖2。

圖1 巖白菜素對照品的光譜掃描圖譜

圖2 巖陀中巖白菜素HPLC圖譜

2.2 對照品溶液的配置 精密稱取干燥至恒量的巖白菜素對照品11.36 mg，置于25 mL的量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.4544 mg·mL-1的巖白菜素對照品溶液。

2.3 標準曲線的繪制 取上述巖白菜素對照品溶液，分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，巖白菜素進樣量（X，μg）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=2×106X-86377（ r=0.9998）。 結(jié)果表明，巖白菜素進樣量在0.9088～5.4528 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 供試品溶液的制備 合并所得濾液，揮干，殘渣加甲醇適量，溶解，全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，臨用前過0.45 μm濾膜。

2.5 巖白菜素含量測定〔5〕取上述對照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，各進樣10 μL，用外標法計算供試品溶液中巖白菜素的含量（mg·g-1），計算公式為：

巖白菜素的含量（ mg·g-1）=（ A供/A對）×C對×25/W

A對為對照品溶液峰面積積分值；A供為供試品溶液峰面積積分值；C對為對照品溶液濃度（mg·mL-1）；25為溶液稀釋倍數(shù)；W為供試品取樣量（g）。

2.6 提取方法的選擇 稱取巖陀細粉（過四號篩）0.5 g，平行3份，精密稱定，分別加20 mL甲醇，用冷浸提取法冷浸24 h；超聲提取法提取20 min；回流提取法提取40 min，濾過，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件操作，各進樣10 μL，測定巖白菜素含量。不同提取方法對巖白菜素含量的影響見表1。

表1 不同提取方法對巖白菜素含量的影響

由表1可知，采用超聲提取法得到的提取物巖白菜素含量最高，因此選擇超聲為提取方法。

2.7 提取溶劑的選擇〔6〕稱取巖陀細粉（過四號篩）0.5 g，平行4份，精密稱定，分別加20 mL的水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯，用超聲提取法提取20 min，濾過，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件操作，各進樣10 μL，測定巖白菜素含量。不同提取溶劑對巖白菜素含量的影響見表2。

表2 不同提取溶劑對巖白菜素含量的影響

由表2可知，采用甲醇作為提取溶劑得到的提取物巖白菜素含量最高，因此選甲醇為提取溶劑。

2.8 正交試驗 稱取巖陀細粉（過四號篩）0.5 g，平行9份，精密稱定，按L9（34）表下條件進行提取，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件操作，各進樣10 μL，測定巖白菜素含量。根據(jù)預試驗結(jié)果，選擇溶劑濃度（A），溶劑體積（B），提取時間（C）和提取次數(shù)（D）為考察因素，按正交設(shè)計表進行試驗。因素水平見表3，正交試驗結(jié)果見表4，方差試驗結(jié)果見表5。

表3 因素水平表

表4 正交試驗結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

由表4、表5可知，4種因素對提取物巖白菜素含量的影響程度依次為C＞A＞D＞B，即提取時間＞溶劑濃度＞提取次數(shù)＞溶劑體積，提取時間、溶劑濃度、提取次數(shù)對提取物巖白菜素含量都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），溶劑體積對提取物巖白菜素含量無統(tǒng)計學意義，且其3個水平結(jié)果相差不大。為了使濾過等操作便于進行，最終確定最佳提取工藝為A2B2C3D3，即用60%的甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min。

2.9 驗證試驗 按正交試驗結(jié)果，稱取巖陀細粉（過四號篩）0.5 g，平行6份，精密稱定，分別加60%的甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min，濾過，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件操作，各進樣10 μL，測定巖白菜素含量。結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果

由表6可知，優(yōu)化得到的工藝簡便、易行，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好，可為進一步開發(fā)利用該藥材提供理論參考。

3 討論

超聲提取法操作簡單、省時，最主要的是提取效果高。作為中藥提取的工藝之一，具有良好的應用前景，且實驗可在室溫下進行，設(shè)備簡單，操作方便〔7〕，是提取巖陀中巖白菜素的一種有效方法。

在超聲條件下提取巖陀中巖白菜素時，根據(jù)預實驗結(jié)果和文獻報道〔3〕綜合分析得知超聲溫度和超聲功率對巖白菜素含量影響微弱，因此未把超聲溫度和超聲功率列入正交試驗。通過正交試驗結(jié)果可知，提取時間、溶劑濃度、提取次數(shù)是影響巖白菜素含量的主要因素，而溶劑體積對巖白菜素含量影響較小。本實驗所優(yōu)化得到的巖陀中巖白菜素提取工藝簡單、經(jīng)濟、穩(wěn)定、可行。

〔1〕貴州省藥監(jiān)局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準〔S〕.貴陽：貴州科技出版社，2003.

〔2〕史彥斌，胡振英，董鵬程，等.中草藥鬼燈檠的現(xiàn)代研究進展〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2004，15（ 9）：23-24.

〔3〕蔡正軍，但飛軍，王威，等.超聲提取鬼燈擎中巖白菜素的最佳工藝研究〔J〕.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2009，26（ 7）：559-561.

〔4〕陳吉生，黃雪瑩.正交試驗優(yōu)選荔枝核總皂苷提取工藝〔J〕.中國藥房，2009，20（ 27）：2107-2109.

〔5〕肖培云，楊永壽，施貴榮，等.HPLC法測定喙尾琵琶甲藥材中氨基酸的含量〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（ 23）：14162-14163.

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〔7〕吳曉寧，張春椿，吳巧鳳.烏蕨總黃酮超聲提取工藝的研究〔J〕.中國中醫(yī)藥科技，2007，14（ 3）：190-191.