何 堅袁 穎李萬里 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

金雀異黃素誘導(dǎo)人白血病Jurkat E6-1細胞凋亡的機制

何 堅1袁 穎2李萬里 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的 探討金雀異黃素(Gen)對Jurkat E6-1人白血病細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。方法 用激光共聚焦技術(shù)觀察金雀異黃素對Jurkat E6-1白血病細胞形態(tài)的影響;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;Western印跡方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3的表達。結(jié)果 Gen各濃度組瘤細胞皺縮、變形，染色質(zhì)濃縮，部分核染色體碎裂，呈高藍低紅色;與1640組相比，Gen各濃度組凋亡率均呈顯著增高，且隨著Gen濃度的升高，凋亡率也增高;Gen 0.1、1.0、10.0 μmol/L組的Bax和Caspase-3蛋白條帶強度遞增，并明顯高于1640組，而Bcl-2蛋白條帶強度則遞減，并明顯低于1640組。結(jié)論 Gen對Jurkat E6-1白血病細胞可能通過上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達來誘導(dǎo)其凋亡。

金雀異黃素;Jurkat E6-1細胞;Bax;Caspase-3;Bcl-2

老年白血病一般多指年逾60歲所患病因不明的原發(fā)造血干細胞的惡性疾病，60歲～69歲的患者占到老年白血病患者的78.6%。白血病的治療以化療、放療治療為主，但是有相當(dāng)?shù)母弊饔?，因此研究無明顯副作用的尤其是對于老年白血病患者的輔助治療方法具有重要意義。金雀異黃素(Gen)是大豆異黃酮的主要成分，是一種天然的植物雌激素，具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗氧化，防止骨質(zhì)疏松等等。研究表明，金雀異黃素可抑制胃癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌細胞等的增殖。但是在白血病方面的研究國內(nèi)外報道少見〔1，2〕。本文研究Gen對Jurkat E6-1白血病細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 Gen購自Sigma公司，RPMI 1640完全培養(yǎng)基、10%的胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。青、鏈霉素雙抗液購自南京凱基生物科技有限公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑、兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、Ecl發(fā)光液、細胞裂解液、蛋白酶抑制劑購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 共聚焦顯微鏡觀察 常規(guī)培養(yǎng)Jurkat細胞。細胞經(jīng)不同劑量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen 處理 48 h 后，離心，PBS 清洗2次，細胞沉淀用1 ml細胞染色緩沖液重懸。分別加入5 μl Hoechst染色液和PI染色液，混勻，冰浴30 min。檢測前離心沉淀細胞，用PBS洗滌一次，涂片在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.2 流式細胞儀分析 常規(guī)培養(yǎng)Jurkat細胞，各組細胞重復(fù)4 次經(jīng)不同劑量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen 處理 48 h 后，PBS清洗2次，取5萬重懸的細胞，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育 10 min。2 000 r/min，離心 5 min，棄上清，加入 190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.3 Western印跡檢測Bax、Bcl-2和Casepase-3的表達 常規(guī)培養(yǎng)Jurkat細胞。各組細胞重復(fù)4次經(jīng)不同劑量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen處理48 h后，收集細胞。提取蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，用封閉液稀釋的鼠抗人Caspase-3或Bax、Bcl-2抗體4度封閉膜過夜，洗滌后將膜于封閉液稀釋的HRP-抗鼠抗體溶液中室溫放置2 h，經(jīng)TBST洗膜后在ECL反應(yīng)液中反應(yīng)1 min，暗室顯影。用β-actin做內(nèi)對照檢測上樣量一致性。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦觀察 1640組細胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，紫外光下呈藍色熒光;而Gen各濃度組瘤細胞則皺縮、變形，染色質(zhì)濃縮，部分核染色體碎裂，呈高藍低紅色(見圖1)。

圖1 激光共聚焦檢測

2.2 流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測結(jié)果 與1640組相比，Gen各濃度組凋亡率均呈顯著增高，且隨著Gen濃度的升高，凋亡率也增高(表1)。

2.3 Gen誘導(dǎo) Jurkat E-6細胞株凋亡中 Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響 0.1、1.0、10.0 μmol/L Gen組的 Bax和Caspase-3蛋白條帶強度遞增，并明顯高于對照組1640組。而Bcl-2蛋白條帶強度則遞減，并明顯高于對照組1640組。表明Gen可上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(圖2，表2)。

表1 GEN對Jurkat E-6細胞凋亡率的影響(±s，n=4)

表1 GEN對Jurkat E-6細胞凋亡率的影響(±s，n=4)

與1640組比較:1)P＜0.01;與GEN0.1 μmol/L組比較:2)P＜0.01

組別 早期凋亡率 晚期凋亡率1640組2.407±0.307 4.315±0.580 GEN0.1 μmol/L組 4.730±0.6391)9.123±0.7391)GEN1.0 μmol/L組 10.615±0.8421)2)15.890±2.6291)2)GEN10.0 μmol/L 組 16.079 ±2.6601)2)36.559 ±4.8721)2)

表2 GEN對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響(±s，n=4)

表2 GEN對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響(±s，n=4)

與1640組比較:1)P＜0.01;與GEN0.1 μmol/L組比較:2)P＜0.01

組別Bax Bcl-2 Caspase-3 1640組0.3±0.034 0.711±0.117 0.349±0.032 GEN0.1 μmol/L組 0.4±0.0561) 0.620±0.068 0.347±0.057 GEN1.0 μmol/L組 0.6±0.0701)2)0.526±0.0441)2) 0.609±0.0691)2)GEN10.0 μmol/L組 0.9±0.1641)2)0.298±0.0491)2) 0.821±0.1311)2)

圖2 凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達

3 討論

白血病患者的免疫功能低下，化療繼發(fā)感染是老年人白血病嚴(yán)重的并發(fā)癥和主要死亡原因之一〔3〕。本研究說明不同濃度Gen組細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象并且和Gen濃度相關(guān)。Gen可通過上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達來誘導(dǎo)人白血病Jurkat E6-1細胞凋亡，王光輝等〔4〕研究表明凋亡機制是通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2來實現(xiàn)的，與本研究結(jié)果一致，是金雀異黃素誘導(dǎo)白血病Jurkat E6-1細胞凋亡的機制之一。

1 Messina M，Hilakivi-Clarke L.Early intake appears to be the key to the proposed protective effects of soy intake against breast cancer〔J〕.Nutr Cancer，2009;61(6):792-8.

2 范玉貞，李國輝，王玉華，等.金雀異黃素的體內(nèi)與體外抗結(jié)腸癌作用及其機制〔J〕.中華腫瘤雜志，2010;32(1):4-9.

3 許惠麗.老年急性髓細胞白血病感染的調(diào)查分析〔J〕.Modern Pre Med，2010;37(23):4552-3.

4 王光輝，陳海峰，王乃利，等.Protobioside抑制腫瘤細胞增殖作用的機制研究〔J〕.中國中藥雜志，2009;34(24):3286-8.

〔2011-05-05收稿 2011-09-12修回〕

(編輯 曹夢園)

R285

A

1005-9202(2012)17-3698-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.040

河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院高學(xué)歷人才科研啟動資助項目(100179)1 廣西醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)科

李萬里(1955-)，男，教授，博士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。第一作者:何 堅(1979-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。