劉宏毅，黎明星、，肖俊、，黃愉淋、，張明，甘西

叉尾斗魚Macropodusopercularis隸屬于鱸形目Perciformes、斗魚科Belontiidae、斗魚屬M(fèi)acropodus，是一種廣泛分布于中國(guó)南方地區(qū)的小型淡水魚類[1]。1868年Carbonier從中國(guó)將叉尾斗魚引入法國(guó)，因其體形美觀，色彩艷麗，故而將其馴化為著名的熱帶觀賞魚種，并得名“天堂魚”。隨后叉尾斗魚作為觀賞魚類，在日本、南美洲以及西歐等地廣為流傳。中國(guó)南方地區(qū)是叉尾斗魚的主要產(chǎn)地，有著豐富的種質(zhì)資源，但因環(huán)境破壞等因素的影響，野生叉尾斗魚數(shù)量正在不斷減少。為了合理保護(hù)和利用叉尾斗魚資源，可以采用先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，開展選育工作，培育出更能迎合市場(chǎng)需要的新品種。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、敏感、產(chǎn)率高等特點(diǎn)，目前已在品種品系遺傳多樣性分析、物種親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系分析等多方面得到廣泛應(yīng)用[2]。一些學(xué)者采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)魚類的遺傳多樣性及群體間的遺傳差異進(jìn)行了研究[3-10]。本試驗(yàn)中，作者采用RAPD技術(shù)對(duì)叉尾斗魚5個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在初步了解叉尾斗魚種質(zhì)資源的狀況，并為該魚的資源保護(hù)和開發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 叉尾斗魚樣本于2009年7月至10月分別采自廣西南寧心圩鎮(zhèn)(15尾)、桂林七星公園風(fēng)景區(qū)(15尾)、福建龍巖新羅區(qū)雁石鎮(zhèn)廈老村(10尾)、福州閩侯上街鎮(zhèn)(15尾)及廣州蘿崗開發(fā)區(qū)華峰寺(15尾)的天然水域，分別稱為南寧群體(NN)、桂林群體(GL)、龍巖群體(LY)、福州群體(FZ)和廣州群體(GZ)，體長(zhǎng)為4.9～7.4 cm，采回后暫養(yǎng)在5個(gè)水族箱內(nèi)備用。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒、Taq聚合酶、dNTP購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，40條10 bp隨機(jī)引物購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DSTM2000 Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(Biometra TGRADIENT)，離心機(jī)(Sigma 1-14)，凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 剪取新鮮叉尾斗魚的背部肌肉，按基因組DNA提取試劑盒操作步驟，進(jìn)行總DNA的提取(確保DNA質(zhì)量)。對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.2.2 引物篩選和RAPD擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，按下列體系和程序進(jìn)行引物篩選和RAPD擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×buffer(含15 mmol/L MgCl2)2.5 μL、模板DNA(50 ng/μL)1.5 μL、引物(10 μmol/L)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性4 min；94 ℃下變性45 s，36 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃下再延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃下保存?zhèn)溆?。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，在15 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離(1×TAE，90 V，約1 h)，用E.B.染色，然后在紫外燈下觀察并拍照。

1.2.3 RAPD數(shù)據(jù)處理 根據(jù)RAPD-PCR的產(chǎn)物電泳圖譜進(jìn)行分析，在電泳條帶中相同的遷移位置，將DNA片段的有和無(wú)分別記為1和0，僅記錄清晰且重復(fù)性好的條帶，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后形成矩陣[11]。將相同遷移距離的條帶看作1個(gè)片段，統(tǒng)計(jì)片段總數(shù)及多態(tài)片段數(shù)，計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比例(P)：

P=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/總位點(diǎn)數(shù)×100%。

采用軟件PopGene 32計(jì)算Shannon指數(shù)和Nei基因多樣性指數(shù)，并進(jìn)一步獲得遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD的擴(kuò)增結(jié)果

從40條引物中篩選出擴(kuò)增效果良好的11條引物用于群體的遺傳變異試驗(yàn)(表1)。對(duì)叉尾斗魚5個(gè)地理群體共擴(kuò)增出139條片段，各群體擴(kuò)增得到DNA片段數(shù)為87～105，每條引物擴(kuò)增的片段數(shù)為8～16，平均為10.73。圖1為用引物W1009602對(duì)叉尾斗魚5個(gè)群體部分個(gè)體擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜。

注：1～4為南寧群體；5～8為桂林群體；9～12為龍巖群體；13～16為福州群體；17～20為廣州群體；M為DS 2000。Note:1-4 NN population; 5-8 GL population; 9-12 LY population; 13-16 FZ population; 17-20 GZ population; M DS 2000.圖1 用引物W1009602對(duì)叉尾斗魚5個(gè)群體部分個(gè)體的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of individuals in 5 populations of paradisefish by the primer W1009602

編號(hào)No.引物序列primer sequences擴(kuò)增條帶數(shù)bandsW1009570CGCCATAGCC14W1009572CCGCCCAAAC16W1009573TTCCCGTGCC15W1009582CCATCGGAGG16W1009590AGTCGGCCCA16W1009592ACCACCCGCT16W1009593AGTCCCCCTC9W1009598GAAACGGGTG11W1009600GTGATCGCAG8W1009602AGCCGACGAA8W1009603GACCGCTTGT10

2.2 遺傳多樣性

對(duì)叉尾斗魚5個(gè)地理群體的相關(guān)遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。叉尾斗魚5個(gè)群體的Nei基因多樣性指數(shù)為0.1042～0.1457,Shannon指數(shù)為0.1543～0.2176。

2.3 遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離

根據(jù)11個(gè)有效引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果轉(zhuǎn)化成0、1矩陣，再將數(shù)據(jù)輸入到Popgene 32軟件中，計(jì)算出叉尾斗魚5個(gè)群體間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見表3。遺傳相似性系數(shù)是衡量種質(zhì)資源變異水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)，相似性系數(shù)越大，兩個(gè)群體間的親緣關(guān)系越近，反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表3可見，各群體間的相似性系數(shù)為0.5769～0.7831，其中福州群體與龍巖群體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而廣州群體與桂林群體的關(guān)系最近。

表2 叉尾斗魚5個(gè)群體的RAPD片段數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)

表3 叉尾斗魚5個(gè)群體的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離

注：對(duì)角線以上的數(shù)據(jù)為遺傳相似系數(shù)；對(duì)角線以下的數(shù)據(jù)為遺傳距離。

Note:The data above diagonal line are genetic similarity and the data below diagonal line genetic distance.

2.4 聚類分析

通過(guò)PopGene 32軟件對(duì)RAPD數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用UPGMA做聚類分析，其聚類結(jié)果可以初步反映出各群體間的親緣關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 叉尾斗魚5個(gè)群體的聚類分析圖Fig.2 RAPD cluster analysis of five popolations of paradisefish M.opercularis

3 討論

3.1 不同地理群體叉尾斗魚的遺傳多樣性

叉尾斗魚5個(gè)群體中共檢測(cè)到139個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)為118個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比例為84.89%。各群體內(nèi)部的多態(tài)位點(diǎn)比例為26.44%～40.95 %，Shannon指數(shù)為0.1543～0.2176，Nei基因多樣性指數(shù)為0.1042～0.1457；而總?cè)后w的Shannon指數(shù)高達(dá)0.4606，Nei基因多樣性指數(shù)高達(dá)0.3110。本研究結(jié)果表明，叉尾斗魚群體內(nèi)的多樣性較低，其遺傳差異主要來(lái)自群體間。這與何燕林等[12]對(duì)圓尾斗魚以及王培欣等[8]對(duì)叉尾斗魚不同地理群體的RAPD研究結(jié)果相似。

叉尾斗魚屬于濕地動(dòng)物，各地理群體間缺乏重大隔離，其親緣地理學(xué)可能與河流物種有所不同[13]。叉尾斗魚分布廣泛，屬連續(xù)分布物種，但由于人為干擾、環(huán)境破壞，叉尾斗魚的生境正不斷縮小、支離破碎，這些破碎的生境宛如被海洋隔離的一座座孤島，各地理群體間缺乏基因交流，同時(shí)為了適應(yīng)當(dāng)?shù)氐纳瞽h(huán)境，各地理群體獨(dú)立進(jìn)化，因此，造成了叉尾斗魚群體間遺傳差異較大[14]。而各群體內(nèi)部遺傳多樣性水平較低的原因，可能是由于叉尾斗魚生境易受破壞，極易造成其數(shù)量波動(dòng)，又因叉尾斗魚具有較強(qiáng)的繁殖能力，其種群數(shù)量特征常表現(xiàn)為先急劇減少，后又增加[15-16]。因此，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，這5個(gè)叉尾斗魚群體都曾遭受不同程度的“瓶頸效應(yīng)”的打擊，其中以福州、龍巖兩個(gè)群體所經(jīng)歷的瓶頸最為嚴(yán)重。

3.2 叉尾斗魚的開發(fā)利用

叉尾斗魚作為世界上最早的熱帶觀賞魚品種，享有“天堂魚”的美譽(yù)。在西方國(guó)家，叉尾斗魚是最受歡迎的觀賞魚種之一。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球觀賞魚類年貿(mào)易總額高達(dá)50億美元，并以年均10%以上的速度增長(zhǎng)，全球觀賞魚產(chǎn)業(yè)表現(xiàn)出迅猛發(fā)展的態(tài)勢(shì)[17]。一直以來(lái)，中國(guó)將觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)看成是副業(yè)，過(guò)分強(qiáng)調(diào)食用魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中的支柱地位，致使觀賞魚產(chǎn)業(yè)停滯不前，養(yǎng)殖技術(shù)落后，產(chǎn)量極不穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著中國(guó)人民生活水平的不斷提高，中國(guó)對(duì)觀賞魚的需求量也在日益增長(zhǎng)，觀賞魚產(chǎn)業(yè)正蓬勃發(fā)展。目前，市場(chǎng)上常見的觀賞魚類除金魚外，絕大多數(shù)都是外來(lái)物種，而中國(guó)本土觀賞魚類資源卻沒有得到很好的開發(fā)和利用，特別是叉尾斗魚[18]。中國(guó)南方地區(qū)是叉尾斗魚的主要產(chǎn)地，有著良好的種質(zhì)資源。本研究結(jié)果表明，叉尾斗魚群體間遺傳多樣性豐富，有較大的選育潛力。因此，可以采用先進(jìn)的遺傳育種技術(shù)對(duì)叉尾斗魚進(jìn)行選育，以便選育出更好的新品種，不斷滿足觀賞魚市場(chǎng)的需求，走一條經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)與物種保護(hù)相結(jié)合的可持續(xù)發(fā)展道路。

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