宋 建 國, 肖 永 坤, 王 東 明, 魚 紅 閃, 金 鳳 燮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

藥材人參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Meyer)的干燥根和塊莖[1],是馳名中外的中藥。人參皂苷是人參主要的有效成分,天然存在的人參皂苷往往是大體積的多糖基皂苷,如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re等；而另外一些皂苷,如Rh1、Rh2、F1、C-K等皂苷在野生人參或紅參中含量都極低,被稱為稀有人參皂苷[2]。研究表明,口服人參以后,主要皂苷在人的消化系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)化成稀有皂苷后吸收起藥效[3],但這種轉(zhuǎn)化的程度是因人而異的,因此制備稀有皂苷具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室工作人員多年致力于制備稀有人參皂苷[4-6]的研究,并報(bào)道了多種人參皂苷糖苷酶,如Ⅰ型人參皂苷糖苷酶[7]、Ⅱ型人參皂苷糖苷酶[8]和Ⅳ型人參皂苷糖苷酶[9]等。其中,Ⅳ型人參皂苷酶能水解原人參三醇類皂苷(protopanaxatriol ginsenoside)6-O-上的多種糖基,例如,人參皂苷Re上的6-O-鼠李糖基、R1上的6-O-木糖基、Rg2上的6-O-鼠李糖基和Rf上的6-O-葡萄糖基。

稀有人參皂苷F1在天然人參根中幾乎不存在,僅少量存在于人參莖葉中[2],但它卻是Re等三醇類皂苷在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,即起藥效的物質(zhì)[10-11]。F1屬于PPT型人參皂苷,與Re、Rg1具有相同的母環(huán)結(jié)構(gòu),它們?cè)?0-O-上都有一個(gè)葡萄糖基,僅在6-O-上的糖基不同,Re比Rg1多一個(gè)鼠李糖,Rg1比F1多一個(gè)葡萄糖,因此,可利用它們結(jié)構(gòu)上的關(guān)系,采用酶轉(zhuǎn)化法,對(duì)低糖基的皂苷進(jìn)行制備。Ⅳ型人參皂苷糖苷酶可先水解掉Re上的6-O-鼠李糖基生成Rg1,再水解掉Rg1上的6-O-葡萄糖基生成F1[9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)以人參皂苷Re為底物,采用酶轉(zhuǎn)化法,利用Ⅳ型人參皂苷糖苷酶制備了Rg1和F1的混合物粗產(chǎn)品,本研究是利用大孔吸附樹脂和硅膠柱層析法分離純化人參皂苷Re的酶解產(chǎn)物,即Rg1和F1,達(dá)到制備稀有人參皂苷F1的目的。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Re、Rg1、F1、人參皂苷Re酶解產(chǎn)物,本實(shí)驗(yàn)室提供；大孔吸附樹脂,南開大學(xué)化工廠；硅膠,青島海洋化工廠；薄層層析板Silica Gel 60-F254,德國Merck公司；高效液相色譜儀,美國Waters公司；色譜所用試劑為色譜醇,其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析醇。

1.2 方 法

1.2.1 大孔吸附樹脂法脫糖、脫色

分別采用大孔吸附樹脂AB-8和D-296對(duì)Re的酶解產(chǎn)物進(jìn)行脫糖脫色處理。

樹脂的預(yù)處理:先將樹脂用甲醇浸泡12 h,然后用去離子水洗至出水清亮無色,再以5%的NaOH和HCl交替處理,在堿洗和酸洗之間用去離子水洗至中性,交替處理兩個(gè)循環(huán)。最后用5%的NaOH溶液再生,水洗至中性后待用。

脫糖:將樣品溶于水中后,上柱,直至皂苷全部被吸附,然后用水洗柱子,洗至無糖為止,再用75%的乙醇將樹脂吸附的皂苷全部洗脫下來。

脫色:將從脫糖步驟洗脫下來的皂苷溶液直接上D-296脫色柱,最后用1～2倍柱體積的75%乙醇洗脫,收集,至洗脫液TLC檢測(cè)至無樣品為止。

1.2.2 硅膠層析法分離純化F1

樣品膠的制備:將樣品溶于甲醇后,與2.5～3.0倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠混合,在通風(fēng)柜中的水浴鍋上均勻攪拌使其混合完全,顆粒均勻,溶劑充分揮發(fā)干燥后即制得樣品膠。

裝柱:將圓柱形玻璃柱的下端用脫脂棉封好,取300～400目硅膠(樣品質(zhì)量的12倍)作為分離膠,用漏斗勻速裝入玻璃柱內(nèi),使其鋪放均勻平坦,輕輕拍打柱體至柱面不再下降,在硅膠上面平鋪80～100目的硅膠15.0 g,在下面抽真空使其緊實(shí),最后加入樣品膠。

洗脫:先用純氯仿通柱,洗脫硅膠中的雜質(zhì)和極性較小的色素等物質(zhì),然后以氯仿-甲醇洗脫液[V(氯仿)∶V(甲醇)=9.0∶1.0]進(jìn)行洗脫,薄層層析跟蹤檢測(cè)結(jié)果,直至人參皂苷Rg1全部洗脫下來。最后以純甲醇洗柱,直到點(diǎn)板無樣品為止。

1.2.3 人參皂苷的檢測(cè)

薄層層析法(TLC):采用毛細(xì)管吸取樣品液,并少量多次點(diǎn)樣于事先切好的薄層層析板上,電吹風(fēng)吹干。將點(diǎn)好樣品的薄層層析板放入展開劑已揮發(fā)平衡的層析缸中,蓋嚴(yán),待展開劑接近層析板上邊緣時(shí),取出層析板,電吹風(fēng)吹干,噴灑10% 的H2SO4水溶液,加熱顯色。研究所使用的展開劑為氯仿-甲醇-水[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5]。

高效液相色譜法(HPLC):美國Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器,Empower 2色譜工作站,Kromasil C 18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)。柱溫35 ℃,體積流量1 mL/min,按需要配制1 mg/mL 樣品液,樣品進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長203 nm。乙腈-水梯度洗脫,洗脫條件:0～15 min,乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%；16～35 min,乙腈體積分?jǐn)?shù)由20%增至32%；36～50 min,乙腈體積分?jǐn)?shù)由32%增至43%；51～80 min,乙腈體積分?jǐn)?shù)由43%增至100%。

2 結(jié)果與討論

為了將Re的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離提純,首先用大孔吸附樹脂進(jìn)行脫糖、脫色處理,再用硅膠層析法進(jìn)一步純化。純化過程中,采用TLC和HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

2.1 大孔吸附樹脂脫糖脫色

將65.0 g Re的酶解產(chǎn)物按照“1.2.1”中所述的方法,經(jīng)大孔吸附樹脂AB-8脫糖、D-296脫色,濃縮蒸干后稱重,共得到粗產(chǎn)品37.0 g,得率為56.9%。產(chǎn)品用TLC進(jìn)行檢測(cè),如圖1所示。從圖1中可以看出,脫糖、脫色后的粗產(chǎn)品中,主要含有人參皂苷Rg1和F1。對(duì)此粗產(chǎn)品按“1.2.2”所述方法,采用硅膠柱進(jìn)行分離提純。

2.2 硅膠層析分離

將從65.0 g的Re酶解產(chǎn)物經(jīng)脫糖、脫色處理后得到的37.0 g干燥粗產(chǎn)品制成樣品膠。柱子裝好后先用純氯仿通柱,然后以氯仿-甲醇洗脫液進(jìn)行洗脫,每瓶收集200 mL,直到Rg1全洗出為止。TLC跟蹤檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。

將洗脫出來具有相同組分的皂苷減壓濃縮,真空干燥,分別收集稱重。23～33號(hào)瓶為單體F1,共4.75 g,在37.0 g粗產(chǎn)品中的得率為12.8%。采用HPLC方法檢測(cè)分離后的人參皂苷F1的純度,結(jié)果如圖3所示,F1皂苷的純度為98.0%。

收集92～120號(hào)瓶為單體Rg1,共11.2 g,在37.0 g粗產(chǎn)品中的得率為30.2%。經(jīng)HPLC檢測(cè),結(jié)果如圖4所示。Rg1皂苷的純度為96.0%。

Re、F1、Rg1,人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；產(chǎn),粗產(chǎn)品

Fig.1 TLC of crude product after desugarization and decoloration

Re、Rg1、F1,標(biāo)準(zhǔn)品；樣,原料；1～140,收集瓶號(hào)

圖3 人參皂苷F1的HPLC檢測(cè)圖

圖4 人參皂苷Rg1的HPLC檢測(cè)圖

因此,將經(jīng)脫糖脫色處理后得到的37.0 g干燥粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠分離后,得單體F1 4.75 g,在粗產(chǎn)品中的得率為12.8%；得單體Rg1 11.2 g,在粗產(chǎn)品中的得率為30.2%。重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),得到的結(jié)果接近。

3 結(jié) 論

本研究是采用大孔吸附樹脂和硅膠層析相結(jié)合的方法,對(duì)主要含有人參皂苷Rg1和F1兩種物質(zhì)的人參皂苷Re的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化來制備F1,并采用TLC和HPLC兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,65.0 g人參皂苷Re的酶解產(chǎn)物經(jīng)脫糖脫色處理后,得到37.0 g產(chǎn)物粗品,得率為56.9%。此37.0 g粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離純化后,共得到純度為96.0%的Rg1皂苷11.2 g,在粗產(chǎn)品中的得率為30.2%；得到純度為98.0%的F1皂苷4.75 g,在粗產(chǎn)品中的得率為12.8%；重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果接近。由此可見,65.0 g的Re人參皂苷酶轉(zhuǎn)化得到Rg1皂苷的得率為17.2%,得到F1皂苷的得率為7.31%。

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