馮二凱，陳立志＊，劉曉穎，汪孫杰，2，曹 閱，徐 晶，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟動物分子生物學省部共建國家重點實驗室 ，吉林吉林132109；2.江蘇科技大學生物與環(huán)境工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212018）

壞死桿菌病是由壞死梭桿菌（Fusobacterium necrophorum）引起的牛、羊、鹿等家養(yǎng)和野生動物常見的一類傳染病的總稱，主要包括牛肝膿腫［1］、犢牛白喉［2］和羊腐蹄病等。壞死桿菌病臨床發(fā)病率高、危害嚴重，給世界反芻動物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，并正在成為制約我國反芻動物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。

目前，壞死桿菌病的臨床治療以抗生素預(yù)防為主，并輔以臨床處置，然而該措施并未徹底控制該病發(fā)生，反而增加了人們對食品公共安全的擔憂。而據(jù)多年臨床經(jīng)驗證實，疫苗免疫才是預(yù)防和控制壞死桿菌病的根本措施。因為壞死梭桿菌滅活苗在腐蹄病的早期治療過程中發(fā)揮了積極作用，但也暴露其毒副作用大、免疫效果差等缺陷。因而急需開發(fā)一種針對性強、免疫效果好且毒副作用小的亞單位疫苗，以減輕壞死桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟損失。

壞死梭桿菌屬于條件性致病菌，能釋放包括內(nèi)毒素、血凝素、溶血素在內(nèi)多種毒力因子，造成其致病機理非常復(fù)雜。近年來，一種對反芻動物白細胞，特別是對多形核白細胞（polymorph nuclear leukocytes，PMNs）有特異性細胞毒性作用的外毒素—白細胞毒素（leukotoxin，Lkt），因具有良好的免疫原性［3－4］而成為了研制治療壞死梭桿菌病高效疫苗的靶標［5－7］，但目前有關(guān)壞死梭桿菌白細胞毒素報道存在嚴重問題，內(nèi)容涉及白細胞毒素的穩(wěn)定性、分子質(zhì)量、生物學特性等方面［8－10］，這給體外制備壞死梭桿菌天然白細胞毒素疫苗造成很大困難。本研究基于已分離的壞死梭桿菌國內(nèi)流行株，體外考察細菌培養(yǎng)條件對壞死梭桿菌分泌白細胞毒素能力的影響，為研制壞死梭桿菌天然白細胞毒素亞單位疫苗和研究白細胞毒素致病機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌菌株 壞死梭桿菌FN（2）株和FN（AB）株以及抗壞死梭桿菌白細胞毒素BSBSE重組蛋白的兔血清由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所省部共建特種經(jīng)濟動物分子生物學國家重點實驗室提供。

1.1.2 試劑 Ex Taq DNA聚合酶和 DL2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；酶標二抗為北京博奧森公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 壞死梭桿菌生物型鑒定 取出－80℃貯藏的壞死梭桿菌凍干粉，1 mL滅菌生理鹽水溶解后接種10 mL新鮮配制厭氧、無菌腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（prereduced anaerobically sterilized brain heart infusion media，PRAS－BHI），37℃厭氧復(fù)壯培養(yǎng)48 h。革蘭染色確認無雜菌污染。

牛源F.necrophorum流行株的生物亞型鑒定參照專利［11］完成。提取壞死梭桿菌基因組DNA，結(jié)合引物P1、P2和P3完成牛源壞死梭桿菌流行株生物型鑒定。P1和P2分別位于F.necrophorum subsp.necrophorum 亞種（Fnn）和F.necrophorum subsp.funduliform亞種（Fnf）的白細胞毒素啟動子區(qū)，P3為下游公共引物（表1）。

表1 壞死梭桿菌生物亞型鑒定的特異性引物Table1 The specific primers for subtype identification of F.necrophorum

反應(yīng)條件：95℃10 min；94℃1min，56℃50 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，10 g／L瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 壞死梭桿菌上清液白細胞毒性檢測 取已復(fù)壯培養(yǎng)48 h的壞死梭桿菌菌液，按1∶50比例接種新配制PRAS－BHI培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期（OD600 nm＝ 0.8 ～1.0）；4℃，8 000 r／min離心30 min，收集上清，0.2μm 濾器濾過除菌，分裝成小份，置－80℃保存，用于測定白細胞毒性。

無菌采集10 mL牛頸靜脈血，裂解紅細胞制備PMNs。RPMI－1640（100 mL／L 胎牛血清）調(diào)整細胞密度至6×106cells／mL，100μL／孔鋪96孔細胞培養(yǎng)板，同時設(shè)空白對照，PBS填充邊緣孔，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

培養(yǎng)物上清液白細胞毒性測定參照Tan Z L等［12］報道的方法，并加以改良。其過程為：次日，取出過夜培養(yǎng)PMNs細胞，小心吸出殘留RPMI－1640，每孔加入2倍比稀釋的壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液（100μL），混勻后置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸出殘留培養(yǎng)物，PBS清洗2次，每孔加入RPMI－1640（100μL）和20μL MTS［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－5－（3－carboxymethoxyphenyl）－2－（4－sulfophenyl）－2H－tetrazolium，內(nèi)鹽］，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h以形成甲瓚，492 nm處測定各孔吸光度。

1.2.3 細菌生物型對壞死梭桿菌上清液細胞毒性的影響 在PRAS－BHI培養(yǎng)基上，分別厭氧培養(yǎng)FN（2）和FN（AB）至對數(shù)生長期（OD600 nm＝0.93），8 000 r／min離心制備細菌培養(yǎng)物上清液，并參照1.2.2檢測FN（2）和FN（AB）培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性，以分析細菌生物型對細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響。

1.2.4 培養(yǎng)基對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響 為考察培養(yǎng)基對培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響，F(xiàn)N（2）和FN（AB）被分別在PRAS－BHI和改良MEB培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集培養(yǎng)物上清液，檢測其各自培養(yǎng)物上清液白細胞毒性，篩選最適制備白細胞毒素的細菌培養(yǎng)基。

1.2.5 p H對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響分別配制p H 7.3和p H 8.0 兩個梯度 PRASBHI培養(yǎng)基，分別接種已篩選最適壞死梭桿菌，制備培養(yǎng)物上清液，參照1.2.2檢測其各自培養(yǎng)物上清液白細胞毒性，篩選最適制備白細胞毒素的細菌培養(yǎng)基p H（p H 8.0培養(yǎng)物上清液在測定活性前，用2N HCl將p H調(diào)至7.3）。

1.2.6 培養(yǎng)時間對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響 取已復(fù)壯最適生物型F.necrophorum接種PRAS－BHI（100 mL），37℃厭氧培養(yǎng)；分別在6、12、24 h取5 mL細菌培養(yǎng)物用于測定白細胞毒素活性。白細胞毒素制備與活性測定參照1.2.2完成。

1.2.7 Western blot分析 基于已篩選的壞死梭桿菌白細胞毒素最適制備參數(shù)條件，制備壞死梭桿菌上清液3 500 mL，4℃超濾濃縮100倍（截留分子質(zhì)量100 ku），并將截留產(chǎn)物定義為壞死梭桿菌天然白細胞毒素，分裝成小份，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

壞死梭桿菌天然白細胞毒素經(jīng)SDS－PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)移至NC膜上，以抗白細胞毒素BSBSE重組蛋白兔血清為一抗，偶聯(lián)辣根過氧物酶的山羊抗兔IgG為二抗，進行 Western blot分析，DAB顯色，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 壞死梭桿菌生物型鑒定

圖1顯示的是壞死梭桿菌生物型鑒定結(jié)果。從圖中可以看出FN（AB）擴增出片段約為1 076 bp，屬于A型，也就是Fnn；FN（2）株擴增片段大約為809 bp，屬于B型，即Fnf。

2.2 細菌生物型對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響

細菌生物型對壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響如圖2所示。在培養(yǎng)物上清液被稀釋1倍～4倍范圍內(nèi)，F(xiàn)N（AB）培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性要顯著高于FN（2）培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性（P＜0.05）。

圖2 細菌生物型對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響Fig.2 Effect of subtype on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

2.3 培養(yǎng)基對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響

改良MEB培制備的細菌培養(yǎng)物上清液的細胞毒性低于PRAS－BHI制備的細菌培養(yǎng)物上清液的細胞毒性，二者差異顯著（p＜0.05），這種差異在FN（2）和FN（AB）上清液毒性檢測過程中都存在（圖3和圖4）。

2.4 p H對壞死梭桿菌上清液的影響

p H為7.3的培養(yǎng)基制備的壞死梭桿菌上清液對PMNs的細胞毒性作用要高于p H 8.0培養(yǎng)基制備的細菌培養(yǎng)物上清液對PMNs的細胞毒性，但二者之間的差異并不顯著（圖5）。

2.5 培養(yǎng)時間對壞死梭桿菌上清液白細胞毒性的影響

壞死梭桿菌上清液的白細胞毒性自接種細菌開始呈逐漸增強趨勢（圖6），12 h左右時，上清液白細胞毒性達到最大值，然后開始下降，24 h時的培養(yǎng)物上清液白細胞毒性與6 h時的培養(yǎng)物上清液白細胞毒性相似。

圖3 培養(yǎng)基對FN（2）培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響Fig.3 Effect of media on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

圖4 培養(yǎng)基對FN（AB）培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響Fig.4 Effect of media on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum strain AB

圖5 p H對細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒素的影響Fig.5 Effects of p H on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

圖6 培養(yǎng)時間對培養(yǎng)物上清液細胞毒性的影響Fig.6 Effects of culture time on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

2.6 SDS－PAGE電泳與 Western blot分析結(jié)果

壞死梭桿菌天然白細胞毒素經(jīng)SDS－PAGE后（圖7），轉(zhuǎn)移至NC膜上進行免疫活性分析，結(jié)果如圖8所示。基于BHI培養(yǎng)基制備的壞死梭桿菌天然白細胞毒素，有2條帶能被抗重組白細胞毒素BSBSE蛋白片段的兔血清所識別，其中131 ku蛋白質(zhì)與抗重組白細胞毒素BSBSE血清反應(yīng)強烈。

3 討論

白細胞毒素是壞死梭桿菌在增殖過程中分泌至細胞外的一種毒素，因其與壞死梭桿菌致病性密切相關(guān)［13］，而被認為是壞死桿菌感染宿主發(fā)病的重要毒力因子［14－15］。研究表明壞死梭桿菌分泌白細胞毒素的能力受細菌生物型、細菌濃度和培養(yǎng)周期等多種因素的綜合影響［16］。如Sanlan C M 等［10］報道 A型壞死梭桿菌分泌白細胞毒素能力最強，AB型次之，B型最少。在本研究中，為考察細菌生物型對壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響，首先利用壞死梭桿菌生物型鑒定專利技術(shù)對本研究室早期分離保存的壞死梭桿菌臨床分離株的生物型進行了鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果比較了各自生物型細菌上清液的白細胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN（AB）對PMNs的細胞毒性顯著高于FN（2）（B型）（圖2），并且這種毒性差異不因培養(yǎng)基的改變而改變。因而在制備類壞死梭桿菌類白細胞毒素疫苗時，應(yīng)選擇生物型A細菌作為生產(chǎn)用種子菌。

除細菌生物型外，培養(yǎng)基類型對培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性也有很大影響。有研究表明，比起營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或硫乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基，Eugon broth培養(yǎng)基或改良Eugon broth培養(yǎng)基更適合于制備白細胞毒素［17］。但本研究結(jié)果顯示，無論是在以FN（AB）為種子菌的試驗中，還是在FN（2）的試驗中，改良MEB培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性要遠低于PRAS－BHI培養(yǎng)基制備的細菌培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性（圖3和圖4），而MEB培養(yǎng)基以Eugon broth為主要營養(yǎng)成分。這表明PRAS－BHI更適合于制備壞死梭桿菌天然白細胞毒素疫苗；推測培養(yǎng)基影響細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的原因可能與培養(yǎng)基支持細菌生長能力差異有關(guān)。

影響培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的因素還包括培養(yǎng)基p H和細菌培養(yǎng)時間。從本試驗獲得的結(jié)果看，培養(yǎng)基p H對細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性影響并不顯著（圖5），但考慮到白細胞毒素的不穩(wěn)定性，高p H可能會導(dǎo)致白細胞毒素發(fā)生降解，因此制備白細胞毒素的細菌培養(yǎng)基p H范圍建議選擇7.3；培養(yǎng)時間對壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性的影響表現(xiàn)出明顯地生長周期依賴性（圖6）。細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性最大值出現(xiàn)在對數(shù)生長期后期（10 h～12 h），然后開始下降，至24 h時，細菌培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性與6 h時的細菌培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性相似。推測引起細菌培養(yǎng)物上清液白細胞毒性下降的原因可能是進入衰老期的細菌發(fā)生裂解，釋放出大量的蛋白質(zhì)水解酶，導(dǎo)致白細胞毒素被降解［16］。

壞死梭桿菌天然白細胞毒素是一種低穩(wěn)定性細胞外蛋白質(zhì)，這在本研究中也得到了驗證。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2條蛋白條帶能被抗白細胞毒素重組蛋白BSBSE的兔血清所識別（圖7），說明白細胞毒素發(fā)生了降解，但不影響其反應(yīng)原性，這與Tan等報道的結(jié)果一致［9］，綜上所述，預(yù)還原、厭氧無菌心腦浸液肉湯培養(yǎng)基（p H 7.3），培養(yǎng)細菌10 h～12 h左右（對數(shù)生長期），此工藝條件下獲取的細菌培養(yǎng)物上清液的白細胞毒性最大；同時超濾獲得的粗提白細胞毒素經(jīng)Western bolt證實也具有免疫反應(yīng)性，這表明獲得的生產(chǎn)工藝可以作為制備壞死梭桿菌天然白細胞毒素疫苗的生產(chǎn)工藝條件，這些數(shù)據(jù)也將為研制壞死梭桿菌白細胞毒素亞單位疫苗提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝：作者對北華大學生命科學研究中心主任孫新教授給予本試驗的幫助表示衷心地感謝！

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