任 鴻

（山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科，山西太原030024）

大腸癌Cyclin D1多態(tài)性及相關(guān)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的研究

Polymorphism of Cyclin D1 and Expression of Cell Cycle Related Genes in Colorectal Carcinoma

任 鴻

（山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科，山西太原030024）

目的：研究大腸癌中Cyclin D1基因DNA序列的多態(tài)性及其相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平。方法：取55例大腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，抽提病變組織中的基因組DNA，另取24例非癌癥切除的正常組織作為正常對照。通過PCR擴(kuò)增Cyclin D1的4號外顯子的基因組DNA片段，并進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析，統(tǒng)計Cyclin D1第242號密碼子多態(tài)性的分布比例。以Western Blot方法，在蛋白質(zhì)水平檢測相應(yīng)組織中Cyclin D1，Cdk6和pRb的表達(dá)水平及磷酸化水平。將檢測結(jié)果以光密度值進(jìn)行半定量，對比各組不同的Cyclin D1基因型對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：在55例大腸癌中，有12例（21.8%）的基因型顯示為GG；有24例（43.6%）的基因型顯示為AG；有19例（34.5%）的基因型顯示為AA。當(dāng)其基因型為AA和AG時，Cyclin D1表達(dá)水平和pRb磷酸化水平要顯著高于基因型為GG的標(biāo)本（P<0.01）。一般GG型的腫瘤組織中Cyclin D1的表達(dá)水平和pRb磷酸化水平與正常組織無顯著性差異；而AA和AG型的腫瘤組織中，Cyclin D1的表達(dá)水平則分別可以達(dá)到正常組織的（4.87±2.38）倍和（3.43±1.74）倍。病理學(xué)檢測顯示多數(shù)AA和AG型大腸癌的腫瘤分級也顯著高于GG型的標(biāo)本（P<0.05）；但腫瘤分期的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：大腸癌中Cyclin D1基因第242號密碼子具有多態(tài)性。Cyclin D1的等位基因多態(tài)性在很大程度上影響了pRb的磷酸化水平，與大腸癌病理分級以及預(yù)后有密切聯(lián)系。

大腸癌；細(xì)胞周期素D1；等位基因；多態(tài)性

Cyclin D1屬于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)控正常細(xì)胞周期過程中起重要作用［1］。當(dāng)其基因突變引起過度表達(dá)時，往往有助于腫瘤的形成［2］，特別是發(fā)生了G→A轉(zhuǎn)換的Cyclin D1基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有更長的半衰期，使其在細(xì)胞內(nèi)的作用時間延長，破壞了細(xì)胞周期的平衡［3］。本研究對大腸癌組織中Cyclin D1基因多態(tài)性進(jìn)行分析，并檢測Cyclin D1基因的表達(dá)及其相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的水平，闡明Cyclin D1基因?qū)Υ竽c癌的影響。

1 資料與方法

1.1 DAN抽提及PCR擴(kuò)增

取55例大腸癌手術(shù)標(biāo)本，另取24例非癌組織作為對照。各取50 mg組織抽提基因組DNA。各取100 ng DNA樣品通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。引物 ：5′-GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-3′和 5′-GGGACATCACCCTCACTTAC-3′，退火溫度57℃，產(chǎn)物片段的長度為167 bp。

1.2 Cyclin D1基因多態(tài)性的檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行測序，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物為本研究所需的片段，并對癌變組織和正常組織的測序結(jié)果進(jìn)行比對和統(tǒng)計。然后，進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析，以5個單位的限制性內(nèi)切酶ScrFI（New England），于37℃酶切上述PCR產(chǎn)物過夜，隨后在3%Agarose凝膠（含0.5 mg/L Ethidium Bromide，EB）中進(jìn)行電泳，根據(jù)酶切產(chǎn)物的不同條帶，統(tǒng)計各組基因型的比例。

1.3 Western Blot檢測Cyclin D1、Cdk6和pRb的表達(dá)水平及磷酸化水平

取各組標(biāo)本100 mg充分剪碎，研磨成糜狀，置于1 mL蛋白裂解液充分裂解。Bradford法測定樣品中的蛋白含量，將所有樣品的蛋白含量稀釋至等濃度。取15 μL蛋白樣品與15 μL上樣液混勻，沸水浴15 min，上樣至8%的SDS-PAGE，10 mA電泳約4 h。電泳完畢，取下凝膠，蛋白條帶電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，80 V約2 h，硝酸纖維素膜置于封閉液（Pierce）中，4℃過夜。次日，分別加入鼠抗Cyclin D1、鼠抗Cdk6 和鼠抗 pRb（NeoMarker Inc）；然后再加生物素化二抗，堿性磷酸酯酶聯(lián)三抗，搖床震蕩1.5 h，充分反應(yīng)，使之互相結(jié)合，最后加入顯色底物NBT-BCIP（Pierce），在酶催化作用下，顯色于硝酸纖維素膜。通過Quantity One software（BIO-RAD）軟件對各組條帶，掃描拍照；并對其光密度值進(jìn)行半定量分析。

1.4 病理學(xué)分析

有病理科2名高級醫(yī)師對各例大腸癌組織進(jìn)行切片病理學(xué)分析，將病理分級和分期的結(jié)果與各自測得的基因型對照，觀察Cyclin D1多態(tài)性對腫瘤組織的病理學(xué)分級和分期的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Cyclin D1基因多態(tài)性的分布

Cyclin D1基因第242號密碼子等位基因是A的片段未能被ScrFI所酶切，長度仍然是167 bp；等位基因是G的片段被ScrFI所酶切，成為2個小片段，長度分別是146 bp和21 bp。在55例大腸癌患者中，Cyclin D1基因第242號密碼子有34.5%的基因型顯示為AA，顯著高于正常對照組的20.8%（P<0.01）。在大腸癌患者中，等位基因是A的占56.4%，等位基因是G的占43.6%；而正常對照組中，等位基因是A的占43.8%，等位基因是G的占56.2%。由此可見，Cyclin D1基因第242號密碼子的A/G多態(tài)性，顯著影響基因攜帶者對大腸癌的易感性（見圖1）。

圖1 Cyclin D1基因的PCR限制性片段長度多態(tài)性檢測

2.2 Cyclin D1在不同基因型的大腸癌中的表達(dá)水平

在Cyclin D1第242號密碼子，基因型為AA和AG的大腸癌中，Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，分別達(dá)到正常組的（4.87±2.38）倍和（3.43±1.74）倍；均顯著高于基因型為GG的組織（P<0.01）。而GG型組織中Cyclin D1蛋白的水平，僅比正常組略高一些，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

圖2 Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平

2.3 Cdk6和pRb的表達(dá)水平及磷酸化水平

所有大腸癌表現(xiàn)Cdk6高水平表達(dá)，平均達(dá)到正常組的（2.54±1.09）倍。但是Western Blot半定量結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)Cyclin D1基因多態(tài)性對Cdk6的表達(dá)水平?jīng)]有影響（見圖3）。

Western Blot檢測pRb的結(jié)果可見兩條帶，一條分子量較大的代表磷酸化pRb，另一條分子量較小的條帶為去磷酸化pRb。結(jié)果顯示pRb的磷酸化狀態(tài)與Cyclin D1基因多態(tài)性有密切的關(guān)系（P<0.01），基因型為AA和AG的大腸癌中，Western Blot顯示有明顯的磷酸化pRb條帶，而GG型組織中磷酸化pRb條帶基本不可見，與正常組類似，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 Cdk6和pRb的蛋白表達(dá)水平

2.4 Cyclin D1基因多態(tài)性對腫瘤組織病理學(xué)的影響

對所有55例大腸癌患者的癌變組織進(jìn)行病理學(xué)分析，Cyclin D1基因多態(tài)性與腫瘤病理分級具有明顯的相關(guān)性（P<0.05），在GG和AG型組織中以Ⅰ、Ⅱ級為主，在AA型組織中則Ⅲ級較多，其間的差別有顯著性（P<0.05）。但是，在低分期組（Ⅰ、Ⅱ）與高分期組（Ⅲ、Ⅳ）之間，Cyclin D1基因多態(tài)性的影響并不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

Cyclin D 是一種原癌基因［4］。Cyclin D1 基因 4號外顯子的第242號密碼子有A/G多態(tài)性，使其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA發(fā)生不同位點(diǎn)的剪接。這2種不同剪接方式形成的mRNA所合成的蛋白質(zhì)都帶有正常生物學(xué)功能的Cyclin區(qū)（第55～161號氨基酸），但是在G→A轉(zhuǎn)換時，羧基端原有的55個由5號外顯子編碼的氨基酸缺失，轉(zhuǎn)而由4號內(nèi)含子編碼的44個氨基酸的肽段所取代［3］。由于缺失的片段中，包含了富含PEST的降解相關(guān)區(qū)域，就造成了Cyclin D1蛋白質(zhì)代謝過程紊亂，具有了更長久的半衰期［5-6］。對不同腫瘤檢測發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1基因的G→A轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致基因攜帶者有罹患癌癥的傾向［7］。本研究55例大腸癌患者中，Cyclin D1基因第242號密碼子有34.5%的基因型為AA，顯著高于正常對照組20.8%（P<0.01），可見Cyclin D1的A/G多態(tài)性顯著影響患者對大腸癌的易感性。

對Cyclin D1基因的這一多態(tài)性進(jìn)行深入研究，在蛋白水平的檢測顯示，基因型為AA和AG的大腸癌中，Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，均顯著高于基因型為GG的癌癥組織（P<0.01）。據(jù)此推測，Cyclin D1在G→A轉(zhuǎn)換時，缺失了降解相關(guān)的PEST區(qū)域，增加了Cyclin D1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，因此AA和AG基因型的癌癥組織里，其表達(dá)水平會顯著高于GG基因型。

Cyclin D1可以與Cdk4和Cdk6形成復(fù)合體，從而使級聯(lián)的信號分子，如Rb基因的蛋白產(chǎn)物pRb等發(fā)生磷酸化。未磷酸化的pRb與E2F家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻遏細(xì)胞周期的進(jìn)行；當(dāng)它磷酸化之后，就會解除這種抑制作用，引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期［8］。我們也對其中，與Cyclin D1關(guān)系密切的幾種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白進(jìn)行了檢測。Cdk6的表達(dá)在所有基因型的大腸癌組織中，均有高水平表達(dá)。而pRb的磷酸化狀態(tài)則與Cyclin D1基因多態(tài)性有密切的關(guān)系（P<0.01），在基因型為AA和AG的大腸癌中，有明顯的磷酸化pRb條帶；GG型組織中磷酸化pRb條帶基本不可見，類似正常對照組。pRb為重要的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，是G1→S調(diào)控點(diǎn)的中心，pRb的磷酸化是Rb基因調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的主要形式。當(dāng)由于上游Cyclin D1的表達(dá)異常，致使過量的Rb發(fā)生磷酸化時，就會有過多的細(xì)胞進(jìn)入自主分裂，逃避凋亡程序，最終形成組織異常增生或者局部的過度血管化［9］。本研究中對癌變組織進(jìn)行的病理學(xué)分析，也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。Cyclin D1基因多態(tài)性與腫瘤病理分級具有明顯的相關(guān)性（P<0.05），在GG和AG型組織中以Ⅰ、Ⅱ級為主，在AA型組織中則是Ⅲ級的比例較高，其間的差別有顯著性（P<0.05）。有研究報道，在其他腫瘤類型中，Cyclin D1過表達(dá)的癌癥患者容易發(fā)生某些耐藥傾向或者有較差的預(yù)后［10］；通過基因治療的手段，下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，不僅可以改變細(xì)胞的周期，還發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制耐藥細(xì)胞中多種耐藥基因的表達(dá)，提高細(xì)胞對化療藥物的敏感性，改善化療的效果［11］。但是，在低分期組（Ⅰ、Ⅱ）與高分期組（Ⅲ、Ⅳ）之間，Cyclin D1基因多態(tài)性的影響并不具有顯著性（P>0.05）。癌癥是經(jīng)過多基因、多步驟，逐步形成的［12］，可見在腫瘤分期這一方面，Cyclin D1基因并非是主要因素，而由其他的癌基因所控制。

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R657.1

A

1671-0258（2012）04-0057-03

任鴻，女，副主任醫(yī)師，從事外科臨床工作

2012-05-01