周歡麗

(貴州省環(huán)境科學(xué)研究設(shè)計(jì)院，貴陽(yáng) 550081)

隨著公眾環(huán)保意識(shí)的提高，人們對(duì)大氣環(huán)境質(zhì)量提出了越來(lái)越高的要求，只注重粉塵、二氧化硫和氮氧化物的大氣污染防治研究已不能滿足人們對(duì)空氣質(zhì)量的要求，一個(gè)新的污染問(wèn)題——生活垃圾所產(chǎn)生的惡臭污染逐漸引起廣泛重視，惡臭污染防治研究日益活躍[1－2]。

惡臭治理技術(shù)從最初的擴(kuò)散稀釋、水洗，發(fā)展到后來(lái)的吸附、焚燒、化學(xué)吸收，直至新興的生物脫臭、光催化氧化、臭氧氧化、等離子體分解等除臭技術(shù)，不外乎借助于物理、化學(xué)、生物手段，或其聯(lián)合工藝，通過(guò)稀釋中和、吸收轉(zhuǎn)化或生物降解等過(guò)程，使惡臭減輕或消除[3]。其中，利用微生物脫臭的研究集中在幾個(gè)方面，一是應(yīng)用亞硝化細(xì)菌處理生活污水中氨氮;二是采用固定化硝化細(xì)菌對(duì)收集的氣態(tài)氨進(jìn)行處理;三是采用復(fù)合微生物菌劑對(duì)生活垃圾的氣態(tài)氨進(jìn)行除臭處理，其總體代謝選擇性和有效微生物的比例較低。為了提高對(duì)惡臭氣體的生物處理效率，以及能就地處理生活垃圾，通過(guò)對(duì)模擬生活垃圾加入自己篩選、分離和純化、培養(yǎng)的硝化細(xì)菌，進(jìn)行除氨氣脫臭實(shí)驗(yàn)。

1 硝化細(xì)菌降解氨氮的機(jī)理

自然界的硝化菌通過(guò)將氨氧化成亞硝酸鹽和將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，完成硝化作用。根據(jù)其利用的無(wú)機(jī)能源不同，分為兩類亞群:亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌。

亞硝化細(xì)菌將氨氧化成亞硝酸鹽的反應(yīng)過(guò)程可概括為:

硝化細(xì)菌將亞硝酸氧化為硝酸鹽，其氧化過(guò)程如下:

2 材料與方法

2.1 培養(yǎng)基

硝化細(xì)菌培養(yǎng)基:NaNO21 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO40.75 g，Na2CO31 g，NaH2PO40.25 g，加蒸餾水至 1 000 mL，pH保持自然。固體培養(yǎng)基加5%瓊脂。

亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基:(NH4)2SO42.0 g，NaH2PO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.75 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca2CO35.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH保持自然。固體培養(yǎng)基加5%瓊脂。

富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl0.5 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O0.4 g，K2HPO40.5 g，NaHCO31.5 g，CaCl20.1 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH保持自然。固體培養(yǎng)基加5%瓊脂。

氨化細(xì)菌培養(yǎng)基:氨化細(xì)菌培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.001 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，微量元素溶液1 mL，加蒸餾水至1 000 mL，用10%碳酸鈉調(diào) pH 為 7.2 ～7.4。

微量元素溶液:硼酸0.5 g，鉬酸鈉0.5 g溶于100 ml蒸餾水。

2.2 菌株分離與純化

分別采集河水污泥、貴州大學(xué)(南區(qū))動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓旁的土壤、貴州大學(xué)(南區(qū))奶牛場(chǎng)附近的土壤，分裝于三個(gè)不同的滅菌袋中。

由于自然環(huán)境中硝化細(xì)菌的數(shù)量很少，為了提高分離效率，采用先富集培養(yǎng)再分離純化的方法。將采集到的污泥和土壤稀釋后，接入富集培養(yǎng)基中，使硝化細(xì)菌的數(shù)量從天然環(huán)境中劣勢(shì)菌群轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯きh(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群[4]，然后采用濃度梯度平板培養(yǎng)法從富集培養(yǎng)基液中分離菌株，再用平板劃線培養(yǎng)進(jìn)行純化[5]，并進(jìn)行 Griess，s滴定檢測(cè)，作革蘭氏染色鑒定，在顯微鏡下(20×50)觀察菌株形態(tài)，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)對(duì)菌株作初步鑒定。對(duì)所得氨化細(xì)菌進(jìn)行奈氏試劑滴定檢測(cè)。

2.3 除氨實(shí)驗(yàn)

將分離純化的硝化細(xì)菌和氨化細(xì)菌分別接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，制作懸浮液，濃度分別為:1.2 ×108個(gè)/mL 和3.2 ×109個(gè)/mL。

取兩只錐形瓶(一只作實(shí)驗(yàn)用，一只作對(duì)照組)，上部懸掛一支稱量盒，并做滅菌處理(圖1)。將雞蛋表面用75%酒精反復(fù)擦拭無(wú)菌處理，敲開蛋殼，倒入大三角瓶搖勻，然后加入制備好的氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌懸浮液，置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中。稱量盒內(nèi)放入吸收液(0.01 mol/L的硫酸溶液)，用于吸收瓶?jī)?nèi)的氨氣。每隔6個(gè)小時(shí)對(duì)瓶?jī)?nèi)氨氣含量進(jìn)行一次檢測(cè):用移液槍吸取0.2 mL吸收液，加入到0.2 mL酒石酸鉀鈉溶液，搖勻，再加入0.2 mL的納氏試劑，室溫放置10 min左右，在波長(zhǎng)為420 nm處掃描，記錄吸光值，據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(R=0.999 6)計(jì)算氨含量[6]。對(duì)照組僅添加氨化細(xì)菌懸浮液。

式中:CNH3——所取吸收液中氨含量，mg/L;

A——所取吸收液的吸光值。

圖1 除氨實(shí)驗(yàn)示意

2.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中得出的數(shù)據(jù)分析結(jié)果均采用SPSS V11.5軟件完成t檢驗(yàn)，P ＜0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株鑒定

菌種的初步鑒定結(jié)論:從三株菌種的菌落形態(tài)、菌株形態(tài)和生理生化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1，圖2)，初步鑒定菌株X－D－4、X－D－5、X－D－10屬硝化桿菌科(Nitrobacteriace)的硝化細(xì)菌群;菌株Y－D－1、Y－D－2、N－D－1屬硝化桿菌科(Nitrobacteriace)的亞硝化細(xì)菌群。

表1 菌株初步鑒定結(jié)果

圖2 菌落形態(tài)

3.2 氨化曲線

根據(jù)吸收液中氨氣的增加來(lái)計(jì)算氨化作用的速率。

結(jié)果表明:自接種氨化細(xì)菌至10 h這一時(shí)期，氨化細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，氨氣急劇增長(zhǎng)，在20 h左右達(dá)到最大值;之后進(jìn)入穩(wěn)定期，氨氣產(chǎn)生量趨于穩(wěn)定;在60 h之后進(jìn)入衰退期，表明雞蛋作為培養(yǎng)基質(zhì)已然耗盡(圖3)。這變化趨勢(shì)與前人研究類似[7]。

圖3 實(shí)驗(yàn)中氨化曲線

3.3 硝化細(xì)菌除氨效果

對(duì)硝化細(xì)菌除氨效果進(jìn)行分析，從表2可見，在1～20 h階段，氨氣量隨著時(shí)間增加而增加，表明氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期;此后出現(xiàn)降低，說(shuō)明氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，同時(shí)硝化細(xì)菌對(duì)氨化細(xì)菌產(chǎn)生的氨氣加以利用，因此，氨氣量大大減少，與對(duì)照組相比最高去除率達(dá)41%;隨后，由于底物消耗殆盡，氨氣量也隨之減少。

表2 硝化細(xì)菌對(duì)氨氣的去除效果

利用SPSS V11.5對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。從表3可見，添加硝化細(xì)菌前后，方差分別為0.196和0.173，t=4.199，df=12，P=0.000 16 ＜ 0.01，可以認(rèn)為處理組和對(duì)照組有極顯著差異，即添加硝化細(xì)菌可使氨氣濃度極顯著下降。

表3 硝化細(xì)菌去氨效果t－檢驗(yàn)表(α=0.05)

4 結(jié)論

(1)本研究從污泥、土壤中采用先富集培養(yǎng)再分離純化的方法篩選到6株細(xì)菌，經(jīng)初步從形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)判定，它們均屬于硝化桿菌科，其中3株屬于硝化細(xì)菌群，另外三株屬于亞硝化菌群。

(2)氨化細(xì)菌發(fā)生氨化反應(yīng)產(chǎn)生的氨氣是生活垃圾中一種主要惡臭氣體。本研究將篩選得到的硝化細(xì)菌加入反應(yīng)體系，一方面主要通過(guò)其氧化作用中和氨化細(xì)菌所產(chǎn)生的氨氣，另一方面則是在反應(yīng)體系中與“氨氣生產(chǎn)者”——氨化細(xì)菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)快速消耗，兩方面的原因均減少了氨氣的排放量(與對(duì)照組相比，減少了41%)。

(3)本研究提出了硝化細(xì)菌應(yīng)用于氨氣除惡臭的有效性及可行性，提高了惡臭氣體的生物處理效率，拓展了微生物除臭研究的新思路。

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