王亞洲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545005)

HPLC法同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸

王亞洲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545005)

目的建立蝎龍酒(全蝎、當(dāng)歸、白芍、紅花、地龍、威靈仙、杜仲等)中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的測定方法。方法采用反相高效液相色譜法進行定量分析，用Inertsil C8-3柱，乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2)為流動相，體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為340 nm。結(jié)果芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的線性范圍分別為46.69～466.95 μg/mL、11.13～111.35 μg/mL和4.84～48.4 μg/mL;平均加樣回收率分別為101.08%、99.85%和100.34%(n=6)。結(jié)論此法簡便、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和回收率，適用于蝎龍酒中3種成分的同時測定。

高效液相色譜法;蝎龍酒;芍藥苷;羥基紅花黃色素A;阿魏酸

蝎龍酒為廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，處方包括全蝎、當(dāng)歸［1］、白芍［1］、紅花［1］、地龍、威靈仙、杜仲等數(shù)味中藥，有解毒止痛、強筋健骨、活血通經(jīng)等功效，臨床用于治療各種風(fēng)濕痹痛所致四肢麻木、腰膝酸痛、骨質(zhì)增生、跌打損傷、中風(fēng)后遺癥、偏頭痛等，療效明顯［2-3］，副作用小。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對白芍進行鑒別，規(guī)定總固體量不少于1%，并無定量測定內(nèi)容。為進一步提高本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有效地控制成品質(zhì)量，本實驗參閱有關(guān)文獻［4-6］，經(jīng)反復(fù)摸索，建立一種高效液相色譜測定方法，可以同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸3種成分。

1 儀器與試藥

LC—10ATvp高效液相色譜儀(SHIMADZU公司);752型紫外分光光度計(南京麒麟公司);AB—L電子分析天平(梅特勒-托利多公司);MP511電子pH計(上海三信公司)，B2500S型超聲波清洗器(BRANSON公司)。芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110736-200630);羥基紅花黃色素A對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20110311);阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20110406);甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為重蒸餾水，蝎龍酒(本院制劑室自制，批號:110809、110822、110830)。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗Inertsil C8-3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2);檢測波長340 nm;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL。在此色譜條件下，芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸均能夠達到基線分離，其它成分對測定沒有干擾。芍藥苷保留時間約為8.4 min，羥基紅花黃色素A保留時間約為10.7min，阿魏酸保留時間為14.1min。見圖1。

圖1 供試品(A)、陰性對照品(B)和對照品(C)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)，negative sample(B)and mixed reference substances(C)

2.2 對照品溶液的制備稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒質(zhì)量的芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL分別含芍藥苷1 867.8 μg、羥基紅花黃色素A 445.4 μg和阿魏酸193.6 μg，即得。

2.3 供試品溶液的制備精密稱取蝎龍酒10 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 陰性對照品溶液的制備按照處方組成，取除白芍、紅花和當(dāng)歸以外的其余藥材，按工藝要求制成不含芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的合劑，按照供試品溶液制備項下的方法，即得陰性對照品溶液。

2.5 線性范圍考察取上述混合對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成6個質(zhì)量濃度，即得芍藥苷質(zhì)量濃度分別為46.69、93.39、186.78、280.17、373.56、466.95 μg/mL，羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度分別為11.13、22.27、44.54、66.81、89.08、111.35 μg/mL，阿魏酸質(zhì)量濃度分別為4.84、9.68、19.36、29.04、38.72、48.4 μg/mL的溶液。依次進樣，按上述色譜條件測定，再分別以3成分的進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的回歸方程分別為:Y=10 216X+769，r=0.999 7(n=6);Y=24 753X+1 975，r=0.999 5(n=6);Y=83 437X－5 612，r=0.999 4(n=6)。結(jié)果表明，3成分的線性范圍分別為46.69～466.95 μg/mL、11.13～111.35 μg/mL和4.84～48.4 μg/mL。

2.6 進樣精密度試驗分別取上述混合對照品溶液1 000、500、200 μL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成高、中、低3種質(zhì)量濃度。分別在同日內(nèi)連續(xù)進樣5次，計算日內(nèi)精密度，結(jié)果芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的RSD值分別為1.21%、1.07%和1.49%(n=5);在5日內(nèi)連續(xù)進樣5次，計算日間精密度，結(jié)果三者的RSD值分別為1.96%、2.351%和2.14%(n=5)，說明本法進樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗取同一批(批號:110809)蝎龍酒，按供試品溶液制備方法制得6份，再按照上述色譜條件測定。測得芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的RSD值分別為0.77%、1.26%和1.04%，說明本法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗取已知含有量的同一批(批號:110809)蝎龍酒6份，分別置于量瓶中，再加入一定量的混合對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，并按上述色譜條件進行測定。計算結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定按2.3項供試品溶液的制備方法制備3批蝎龍酒供試品溶液，每批進樣5次，按上述色譜條件測定，計算供試品溶液的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 樣品測定結(jié)果(n=5)Tab.2 Results of sample assay(n=5)

3 討論

HPLC法同時測定制劑中幾種成分，選擇合適的檢測波長尤為關(guān)鍵。本實驗將芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的對照品溶液分別進行全波長紫外掃描，確定芍藥苷最大吸收波長為230 nm，羥基紅花黃色素A最大吸收波長為403 nm，阿魏酸的最大吸收波長為327 nm。在上述色譜條件下，分別于230 nm、300 nm、327 nm、340 nm和403 nm等處對供試品溶液進行分析，發(fā)現(xiàn)阿魏酸最大吸收波長327 nm附近的340 nm處所得的HPLC圖譜上各成分峰分離效果較好，雜質(zhì)干擾峰亦被消除，且能較好地兼顧含有量較小的阿魏酸和羥基紅花黃色素A的峰形，因此選擇340nm作為檢測波長。

參考有關(guān)文獻［7-9］，經(jīng)過不同流動相的摸索，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2)為測定流動相時，3成分的出峰時間更合適，峰形好、無拖尾，且不受雜質(zhì)峰干擾。在流動相中少量加入的四氫呋喃，很好的改善了峰形。但四氫呋喃容易與流動相中的溶解氧形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收(特別是在260 nm以下)，導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低［10］，所以試驗流動相必須預(yù)先徹底脫氣。四氫呋喃易被氧化從而可能在色譜圖中產(chǎn)生倒峰，故添加四氫呋喃的流動相宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

反相高效液相色譜法同時測定中藥合劑中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸在國內(nèi)尚未見文獻報道，本實驗建立的測定方法靈敏度高、專屬性好，為其它制劑的HPLC法測定上述3種成分提供了方法參考。相比于文獻［11-12］中的調(diào)pH再乙醚萃取法，本試驗中僅需對合劑稀釋即可進行定量測定，操作簡便易行。對3批樣品分別進行分析，測定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，說明本法可作為控制蝎龍酒質(zhì)量的定量方法。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

［2］楊春旭，戴盛明，李桂生．蝎龍酒對血瘀大鼠血液流變學(xué)及正常大鼠血小板功能影響的實驗研究［J］．廣西醫(yī)學(xué)，2002，24(6):763-764．

［3］朱靈，楊春旭，黎淵弘，等．蝎龍液浸膏體內(nèi)外對動物凝血功能及血栓形成的影響［J］．現(xiàn)代中藥研究與實踐，2008，22(4):22-24．

［4］凌明，馬安宇．HPLC測定胃腸合劑中芍藥苷和黃芩苷的含量［J］．中成藥，2008，30(9):1311-1313．

［5］黃安軍，聶曉玲．HPLC法同時測定乳核內(nèi)消液中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］．西北藥學(xué)雜志，2009，24(6):436-437．

［6］倪文澎，錢平，周琴妹，等．RP-HPLC法同時測定養(yǎng)生丸中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］．中國藥師，2010，13(8):1114-1116．

［7］李生有．HPLC測定丹夏頭痛膠囊中阿魏酸的含量［J］．中成藥，2007，29(2):附6-附7．

［8］王玉華，郝美玲，王偉．HPLC測定蒙成藥檀香清肺二十味丸中羥基紅花黃色素A的含量［J］．中成藥，2008，30(1):143-144．

［9］劉巖，劉順航，賈佳麗，等．HPLC同時測定廣東湯中葛根素和芍藥苷的含量［J］．中成藥，2007，29(6):842-845．

［10］張慶合．高效液相色譜實用手冊［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008，83．

［11］梁陳方，楊春旭，吳洪文，等．高效液相色譜法測定蝎龍酒中阿魏酸的含量［J］．時珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1661-1662．

［12］吳洪文，李明艷．高效液相色譜法測定蝎龍酒中芍藥苷的含量［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(17):1486．

Simultaneous determination of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor by HPLC

WANG Ya-zhou
(The No.4 Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou 545005，China)

AIMTo establish a method for determining the contents of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor(Scorpio，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix alba，Carthami Flos，Pheretima，Clematidis Radix et Rhizoma，Eucommiae Cortex，etc．)．METHODSThe quantitative analysis was carried out by HPLC with an Inertsil C8-3column．The mobile phase was acetonitrile-0.1%phosphoric acid-tetrahydrofuran(18∶80∶2)with a flow rate at 1.0 mL/min．The detection wavelength was set at 340 nm．RESULTSThe linear ranges for paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid were 46.69-466.95 μg/mL，11.13-111.35 μg/mL and 4.84-48.4 μg/mL，respectively．Their average recoveries were 101.08%，99.85%and 100.34%(n=6)，respectively．CONCLUSIONThis method is simple and accurate，with good reproducibility and recovery．It is suitable for the determination of the contents of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor．

HPLC;Xielong Liquor;paeoniflorin;hydroxysafflor yellow A;ferulic acid

R927.2

A

1001-1528(2012)10-1925-04

2012-01-13

廣西科技廳攻關(guān)基金資助項目(9920028);廣西柳州市科技局科技攻關(guān)基金資助項目(990608)

王亞洲(1979—)，男，碩士，主管藥師，從事藥品質(zhì)量控制工作。Tel:(0772)3802560，E-mail:lzpharmacy@163．com