劉茂軍，蘇國東，周勇岐，2，馮志新，王海燕，朱曉瑋，2，邵國青

(1．江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014;2．南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS)又稱豬地方性肺炎，該病是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一種豬慢性呼吸道傳染病，在全世界養(yǎng)豬國家和地區(qū)普遍存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重危害［1－3］。疫苗預防是控制該病的主要手段［4］。豬肺炎支原體168株是江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所連續(xù)傳代培育而成的適應無細胞培養(yǎng)基(KM2)的弱毒株。我們對該弱毒株的安全性進行了研究，確保該菌株疫苗的臨床使用效果。

1 材料

1．1 疫苗、培養(yǎng)基和試劑 豬肺炎支原體168株(X+1)代(5×107CCU/mL)和3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。5批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由南京天邦生物科技有限公司制造。豬肺炎支原體P46基因PCR引物由TaKaRa公司合成。KM2培養(yǎng)基和兔抗豬肺炎支原體J株高免血清由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所制備。

1．2 試驗豬 5～15日齡豬75頭，仔豬和哺乳母豬均為豬肺炎支原體IHA抗體陰性，來源于江蘇省農科院豬場，飼養(yǎng)于江蘇省農科院試驗動物房，各組豬隔離飼養(yǎng)，飼喂無抗生素的飼料，飲用自來水。120頭商品豬來源于廣東某豬場，一直飼養(yǎng)與該豬場。

2 方法

2．1 感染性試驗 用豬肺炎支原體168株X代肺內注射接種5頭5～15 d齡試驗豬，每頭1 mL，另5頭不注射作為崗哨組。在注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～4 d每日上午檢測直腸溫度;并于接種后連續(xù)逐日觀察臨床癥狀至剖殺前，主要觀察觀察是否有精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。在注射后第25 d剖殺所有豬，采集肺臟，檢查是否存在組織病變。肺病變指數按照28分評分法判定［5］。

2．2 毒力返強試驗

2．2．1 連續(xù)感染試驗 用2 mL豬支原體肺炎活疫苗(168株)X代右側肺內接種5頭5～15日齡試驗豬，隔離單圈飼養(yǎng)25 d后，剖檢試驗豬，觀察肺臟是否有胰樣小葉性肺炎病變，并以無菌操作分別從5頭豬右側肺臟剪取注射部位周圍肺組織約5～7 g剪成細塊，混合研磨成糊狀，加入含有1000單位/mL青霉素的Hank’s溶液，配制成5%肺懸液，當日再肺內接種到第二批5～15日齡健康易感豬5頭，2 mL/頭。如此反復連續(xù)接種5代，觀察每代次各接種豬臨床癥狀和肺臟的病理變化。

2．2．2 菌株鑒定 每代次剖殺的豬肺用P46 PCR方法進行檢測，對豬支原體肺炎活疫苗(168株)菌體和第5次回歸豬的PCR擴增產物進行序列分析［6，7］。

2．3 不同免疫劑量安全性試驗 3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)肺內接種健康豬進行一次單劑量、單劑量重復和一次大劑量接種各5頭，分別注射1次1頭份、間隔2周2次各注射1頭份和1次10頭份，每頭份體積均為1 mL;對照組5頭豬同時肺內接種1 mL生理鹽水。各組在當日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～3 d的每日檢測直腸溫度，并于接種后連續(xù)逐日觀察臨床癥狀至剖殺前。接種后第25 d將試驗豬全部剖殺，采集肺臟，對注射部位特別檢查。

2．4 臨床安全性試驗 用5批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)在豬場進行免疫，每批次免20頭，1頭份/頭，對照20頭不免疫。對免疫組和對照組的各豬只在免疫前、免后6 h和免后24 h抽樣檢測直腸體溫，疫苗免疫后28 d內進行臨床觀察，觀察是否有精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。

3 結果與分析

3．1 感染性試驗結果

3．1．1 臨床癥狀觀察 仔豬注射豬支原體肺炎活疫苗(168株)后25 d內，試驗組和崗哨組的豬均表現(xiàn)正常，均未觀察到精神不振、食欲減退、咳嗽、呼吸困難、俯臥、嘔吐、震顫、死亡等不良反應。提示豬支原體肺炎活疫苗(168株)對豬只的影響輕微，沒有可觀察到的臨床癥狀發(fā)生。

3．1．2 注射后的體溫變化 在所有測溫的時間點，試驗組豬的直腸溫度平均值與對照組的相差范圍在0．5℃以內。測得的每組平均直腸溫度見圖1。

3．1．3 大體病理觀察 在注射后25 d進行剖檢，試驗組與崗哨組均未觀察到豬支原體肺炎病變。提示該活疫苗免疫接種后未見眼觀肺臟病變，也未引起同圈豬發(fā)生眼觀肺臟病變。

圖1 豬注射當日前后各時間的平均直腸溫度

3．2 毒力返強試驗

3．2．1 臨床癥狀觀察和肺臟剖檢結果 豬支原體肺炎活疫苗(168株)進行肺內注射豬后，用肺臟懸液連續(xù)5次毒力返強接種試驗豬的臨床觀察、肺臟剖檢結果見表1。

表1 連續(xù)5代毒力返強試驗豬肺臟臨床癥狀、肺臟病變結果

豬支原體肺炎發(fā)病豬的典型癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、氣喘等［6］。由上表可見，豬支原體肺炎活疫苗(168株)肺內注射易感豬均表現(xiàn)正常，未觀察到該病的臨床癥狀。第2～5代連續(xù)返強試驗接種時，接種豬也未見明顯臨床反應，病理剖檢均未產生眼觀典型的豬支原體肺炎病變。對每代連續(xù)返強試驗接種的肺組織均可檢出豬肺炎支原體，第5代返強試驗豬撲殺的分離物經代謝抑制試驗鑒定為豬肺炎支原體。連續(xù)5代返強試驗的臨床癥狀和大體剖檢結果提示在5代次內該疫苗菌株毒力穩(wěn)定，逐次傳遞沒有返強跡象。

3．2．2 菌株分離和鑒定 用該活疫苗(168株)肺內注射后的肺臟懸液連續(xù)5次接種試驗豬，逐次剖取各批次豬的肺臟接種于KM2培養(yǎng)基后均分離獲得的疑似豬肺炎支原體菌體，經代謝抑制試驗鑒定均與豬肺炎支原體J血清型一致，因豬肺炎支原體僅有一個血清型，所以分離到的菌株為豬肺炎支原體。再用豬肺炎支原體特異性P46引物進行PCR擴增，結果均擴增到了目的條帶。對豬支原體肺炎活疫苗(168株)的菌液和從第5次豬肺分離的豬肺炎支原體的PCR擴增產物進行測序，序列分析結果顯示兩者序列完全一致。

3．3 不同免疫劑量安全性試驗

3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)進行一次單劑量、單劑量重復和一次大劑量各接種5頭健康豬的安全性試驗。另對照組5頭，各組在當日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～25 d的每日檢測直腸溫度，與對照組相比均未超過1℃(圖2～圖4)。注射后第1～25 d試驗豬均表現(xiàn)正常，未觀察到呼吸困難、俯臥、嘔吐、食欲不振、震顫和死亡等臨床癥狀。在注射后25 d進行剖檢，試驗組注射部位有白色斑痕，無豬支原體肺炎病變，對照組未觀察到異常。

3．4 臨床安全性試驗

5批次疫苗免疫后28 d內臨床觀察，結果均表現(xiàn)正常，未見精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。免疫組和對照組的豬在進行抽樣檢測直腸體溫(圖5)，結果顯示免疫組豬的直腸溫度平均值與對照組的相差范圍在0．5℃以內。

圖2 豬支原體肺炎活疫苗(168株)一次單劑量免疫豬的平均直腸體溫變化

4 討論與結論

疫苗免疫是防控豬支原體肺炎病的最有效措施之一。目前市面上的豬支原體肺炎疫苗有國產的活疫苗和進口的滅活疫苗。其中滅活疫苗安全性和免疫效力均好，但其價格昂貴限制了廣泛使用;活疫苗安全性好，免疫效力高，價格低廉，在國內正在替代滅活疫苗市場。而安全、有效和質量可控是疫苗研究的核心，其中又以安全性最為重要。因此，我們對豬支原體肺炎活疫苗(168株)的安全性從不同代次、疫苗的不同劑量安全性和臨床應用等方面進行了試驗觀察。

5～15日齡是豬對豬肺炎支原體的易感期。同群感染性試驗選用健康易感豬用高濃度的豬肺炎支原體(5×107CCU/mL)進行感染，結果顯示免疫豬未觀察到豬支原體肺炎的臨床癥狀和大體病理變化，同時同群感染豬也未觀察到異常癥狀和變化。五代次連續(xù)感染試驗證實豬肺炎支原體168株試驗豬均未觀察到豬支原體肺炎的臨床癥狀和病理變化。這兩個試驗證實制苗用菌株對豬安全，不會返強。大劑量和單劑量重復是對疫苗的又一嚴格的安全性評估，本研究中接種豬均未觀察到異常臨床表現(xiàn)，同時也未觀察到肺部病變。同時，還用疫苗進行了臨床應用結果也顯示疫苗安全。上述結果都說明豬支原體肺炎活疫苗(168株)具有良好的安全性。

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［5］ 金洪效，儲靜華，毛洪先，等．豬氣喘病弱毒株免疫研究［J］．中國獸醫(yī)科技，1989，1:3 －6．

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