張桂東 宋春麗 周少英 武來興 尹清臣

近些年來膽管癌的發(fā)病率逐漸升高，雖然醫(yī)學(xué)影像學(xué)和臨床其他檢測(cè)方法的有所提高，但是由于膽道系統(tǒng)的解剖和生理學(xué)特點(diǎn)，早期診斷和早期治療均較困難，導(dǎo)致許多患者就診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，且膽管癌的惡性程度較高、預(yù)后差，給普通外科醫(yī)生提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助因子，在DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)PCNA在膽管癌中的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法，RT-PCR方法來檢測(cè)PCNA在膽管癌組織中的表達(dá)，探討它們與膽管癌臨床病理因素之間的關(guān)系。旨在為判斷膽管癌的惡性程度和生物學(xué)行為提供客觀指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例原發(fā)性膽管癌、17例相同個(gè)體癌旁膽管組織及20例正常膽管組織來自邯鄲市中心醫(yī)院2005年12月至2010年12月手術(shù)切除標(biāo)本。所有膽管癌患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。所有標(biāo)本為術(shù)中立刻獲取的新鮮膽管癌組織、相同個(gè)體癌旁(距瘤緣0.5 cm)膽管組織及正常膽管組織，保存于液氮中，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。術(shù)后膽管癌標(biāo)本立刻固定在10%中性甲醛溶液，包埋在石蠟里，用于免疫組化研究。為避免誤差，由兩位有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師進(jìn)行病理組織學(xué)診斷。42例膽管癌患者中男23例，女19例;年齡40～76歲，平均年齡60歲;高和中分化膽管癌27例，低分化膽管癌15例;肝門部25例，中下段17例;其中有14例發(fā)生了淋巴轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑 鼠抗人PCNA單克隆抗體(北京中杉公司);FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch Laboratiries Inclot58630);Trizol試劑(美國(guó) Gibco BRL公司);RT試劑盒(美國(guó)Promega公司);PCR酶混合物(賽百盛生物工程公司);dNTP(賽百盛生物工程公司);GAPDH引物(上海生工生物工程公司);PCNA引物(上海生工生物工程公司);100 bp DNA marker(賽百盛生物工程公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 采用免疫組化SP法，對(duì)標(biāo)本中的PCNA蛋白進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行操作;結(jié)果判定免疫組化根據(jù)染色反應(yīng)的深度及陽性細(xì)胞的數(shù)量分別記分為0～3分，其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)。不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10% ～45%為1分，46% ～70%為2分，＞70%為3分，并根據(jù)這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)分為陰性結(jié)果和陽性結(jié)果，即陰性(－)為0～1分，陽性(+)為2～9分。

1.3.2 采用RT-PCR法，對(duì)標(biāo)本中的PCNA mRNA進(jìn)行檢測(cè)，亦按試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，不同組別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用t檢驗(yàn)(LSD法)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 膽管癌組織、正常膽管組織中PCNA表達(dá)的陽性率分別為71.19%(30/42)和25.00%(5/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.205，P=0.001)。膽管癌組織的陽性率亦明顯高于正常組織;膽管癌組織中PCNA蛋白的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤所處位置，組織學(xué)分化及其淋巴轉(zhuǎn)移的比較見表1。

表1 PCNA蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系(免疫組化) 例(%)

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 膽管癌組織的PCNA mRNA表達(dá)高于正常組織有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.84，P=0.0001)。見表2。

表2 PCNA mRNA在膽管癌組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(dá)(RT-PCR)±s

表2 PCNA mRNA在膽管癌組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(dá)(RT-PCR)±s

注:與膽管癌組比較，*P ＜0.05

組別PCNA OD值正常膽管組(n=20) 0.5605 ±0.0331*膽管癌旁組(n=17) 0.5692 ±0.0408*膽管癌組(n=42)0.6303 ±0.0773

2.3 膽管癌組織中PCNA mRNA的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系見表3。

3 討論

膽管癌系指發(fā)生在膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤。膽管癌患者早期一般無明顯臨床表現(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)膽道惡性腫瘤的特異性的標(biāo)志物，因而膽道系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷仍主要靠傳統(tǒng)的影像學(xué)技術(shù)，如B型超聲，內(nèi)鏡逆行性膽胰管造影(ERCP)、CT、磁共振膽胰管成像(MRCP)核素顯影掃描和血管造影等。同時(shí)膽管癌的治療仍以手術(shù)切除為主，放療和化療的療效尚需進(jìn)一步探索。而基因診斷和基因治療可能成為今后的發(fā)展方向或成為攻克膽管癌的最終途徑。

表3 PCNA mRNA在膽管癌組織中的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系(RT-PCR)±s

表3 PCNA mRNA在膽管癌組織中的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系(RT-PCR)±s

臨床參數(shù) PCNA OD值 P值性別男(n=23) 0.6509 ±0.0592女(n=19) 0.6240 ±0.0458 0.108年齡(歲)≤60(n=24) 0.6507 ±0.0467＞60(n=18) 0.6389 ±0.0464 0.436腫瘤位置肝門部(n=25) 0.6382 ±0.0417中下段膽管(n=17) 0.6501 ±0.0527 0.419組織學(xué)分級(jí)中 ～高分化(n=27) 0.6212 ±0.0224低分化(n=15) 0.6361 ±0.0161 0.029淋巴轉(zhuǎn)移情況未轉(zhuǎn)移(n=28) 0.6202 ±0.0555已轉(zhuǎn)移(n=14)0.6323 ±0.0390 0.470

膽管癌的病因和發(fā)病機(jī)理同其他器官的惡性腫瘤一樣目前仍尚未完全明了。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其可能與結(jié)石形成、膽汁淤積及膽道感染有關(guān)［1］。目前遺傳學(xué)的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與其他惡性腫瘤一樣，膽管癌的發(fā)生發(fā)展與染色體癌基因及抑癌基因的改變有關(guān)，認(rèn)為k-ras、c-myc、c-met等的過度表達(dá)及其抑癌基因p53、p16、DPC4等的突變?nèi)笔c膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但各種癌基因和抑癌基因在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用及其協(xié)調(diào)關(guān)系尚不清楚［2］。因此進(jìn)一步從分子生物學(xué)的角度研究膽管癌的發(fā)病機(jī)制，可望為膽管癌的基因診斷和治療提供理論依據(jù)。

PCNA基因位于20號(hào)染色體上，含6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)約710 kb，編碼36 KD的PCNA蛋白。PCNA蛋白亦為一種細(xì)胞周期蛋白，是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，是DNA多聚酶δ的輔酶，它協(xié)調(diào)DNA前導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成，是DNA復(fù)制過程所必需［3］，其在細(xì)胞內(nèi)的含量具有周期性，在靜止期細(xì)胞內(nèi)含量很少，G1晚期開始增加，S期達(dá)高峰，G2期、M期明顯下降［4］，正常情況下，p21蛋白與 PCNA結(jié)合形成復(fù)合物，抑制PCNA的功能，在多種基因或細(xì)胞因子的調(diào)控下，PCNA含量超過p21蛋白的結(jié)合能力時(shí)，即可與相應(yīng)的DNA復(fù)制位點(diǎn)結(jié)合，輔助DNA聚合酶δ進(jìn)行DNA復(fù)制，從而使細(xì)胞進(jìn)入S期［5］。PCNA是一種酸性、無組蛋白的細(xì)胞核多肽，其陽性細(xì)胞多分布于癌巢周邊和浸潤(rùn)前緣，在癌巢中央尤其是明顯角化的細(xì)胞中表達(dá)極低。近些年來，國(guó)際上對(duì)PCNA的的研究一直比較熱［6，7］，國(guó)內(nèi)張?jiān)龋?］的研究結(jié)果，表明 PCNA 能較好地反映胰腺癌的惡性程度和增殖活性，提示它可作為反映胰腺癌預(yù)后的一個(gè)可靠參數(shù)，羅慶元等［9］的研究結(jié)果，亦表明PCNA能較好地反映食管癌的增殖活性，提示它也可作為反映食管癌預(yù)后的一個(gè)較好參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)從蛋白和基因兩個(gè)水平上來研究PCNA在不同膽管病變中的表達(dá)，從而探討PCNA表達(dá)異常與膽管癌發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中利用免疫組化方法和RT-PCR法檢測(cè)了42例膽管癌組織和20例正常膽管組織中PCNA的表達(dá)情況。42例膽管癌患者中男23例，女19例;年齡40～76歲，平均年齡60歲;高和中分化膽管癌27例，低分化膽管癌15例;肝門及肝內(nèi)膽管癌25例，中下段17例。其中有14例發(fā)生了淋巴轉(zhuǎn)移。從試驗(yàn)結(jié)果可以得出，蛋白和基因兩個(gè)水平上的PCNA在不同膽管病變中的表達(dá)具有一致性，即在膽管癌中的表達(dá)明顯高于正常的膽管組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步研究表明，PCNA的表達(dá)隨著腫瘤的惡性程度的升高(即腫瘤的病理學(xué)分化程度的降低)而升高，更進(jìn)一步說明了PCNA是一個(gè)有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志。

1 黃潔夫主編.肝臟膽道腫瘤外科學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999.710-711.

2 鄒聲泉，龔建平主編.外科學(xué)——前沿與爭(zhēng)論.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.604-605.

3 Waga S.The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA.Nature，1994，369:574-578.

4 Zhu SC，Li R.Impact of simultaneous assay.the PCNA，cyclinD1，and DNA content with specimens before and after preoperative radiotherapy on prognosis of esophageal cancer-possible incorporation into clinical TNM stag system.World JGastroenterol，2005，11:3823.

5 Moldovan GL，Pfander B，Jentsch S.PCNA，themaestro of the replication fork.Cell，2007，129:665-679.

6 Fan J，OtterleiM，Wong HK，etal.XRCC1 co-localizes and physically interacts with PCNA.Nucleic Acids Res，2004，32:2193-2201.

7 Bravo R，F(xiàn)rank R，Blundel P，et al.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta.Nature，1987，326:515-517.

8 張?jiān)X家勤.胰腺癌組織中增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)及臨床意義.肝膽外科雜志，2000，8:434-436.

9 羅慶元，蔣瑩.食管鱗癌組織中c-fos和PCNA的表達(dá)及臨床病理意義.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33:30-35.